馬鈴薯Y病毒復制酶基因介導的病毒抗性研究.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬是植物病毒中最大的一個屬，包括馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）等，對世界范圍內的經(jīng)濟作物造成的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失嚴重。PVY存在著明顯的株系分化現(xiàn)象，在寄主與病原相互作用中，且隨著抗病品種等的應用，新的株系將會不斷出現(xiàn)。RNA介導的病毒抗性（RNA-mediated virus r

2、esistance，RMVR）是近年來發(fā)展起來的一種新的抗病毒基因工程策略，具有抗病程度高（近乎免疫）、抗性持久、生物安全性高等優(yōu)點。RNA介導的抗性也存在著一定的局限性，即抗性譜較窄，但這種局限性可以用同時表達多個不同的病毒RNA序列所彌補，所以可以把不同病毒的有效核酸片段連接起來轉化植物，獲得多抗植株。在前期的研究中，我們對CP基因在RNA水平上介導的病毒抗性進行了深入系統(tǒng)地研究，并且發(fā)現(xiàn)CP基因的3’端和5’端序列介導的病毒抗性存

3、在顯著差異?；谏a(chǎn)中存在的問題和本實驗室的研究基礎，本研究的第一個內容用馬鈴薯Y病毒的復制酶基因（nuclear inclusion b，NIb）的保守序列作為轉基因材料，探討核苷酸序列同源性與RNA介導的病毒抗性產(chǎn)生的關系，以及利用同源片段培育多抗病毒（株系）的可能性，研究結果為進一步闡明RNA介導基因沉默（病毒抗性）產(chǎn)生的機制，及利用該策略培育多抗病毒（株系）轉基因植物提供依據(jù)。第二個內容是用馬鈴薯Y病毒NIb基因不同位置51bp

4、長度片段構建反向重復轉基因結構，探討NIb基因不同位置的cDNA區(qū)段對RNA介導病毒抗性的影響，本研究結果對于有效地選擇靶位點序列和成功應用RNA介導的病毒抗性策略，具有重大指導意義，研究結果和主要結論如下：
　　 根據(jù)已克隆的PVY-SD1 N Ib的全長cDNA序列（1557bp）序列設計了5段保守序列基因片段的特異引物，以PVY-SD1NIb的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到相應的基因擴增產(chǎn)物，雙酶切純化后，與用相同酶

5、處理的pROKⅡ連接，熱激法轉化大腸桿菌DH5α，篩選并獲得重組表達質粒PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ。酶切鑒定表明成功構建了植物表達載體。將成功構建的植物表達載體利用凍融法直接導入農(nóng)桿菌LBA4404。葉盤法轉化煙草NC89。再生植株經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR檢測，結果表明，轉化PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ分別獲得168、150、166、155和170株T0

6、代轉基因植株。5種轉基因煙草分別接種PVY3個分離物和TEV-SD1分離物后，發(fā)現(xiàn)：5個轉基因株系PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ接種分離物PVY-SD1，轉基因植株中抗性植株的比例分別為26.4％、22.6％、36％、20.2％和21.7％；接種分離物PVY-SD5，除了轉基因株系PRIR-Ⅳ（84.3％）未獲得抗性植株外，其余4個轉基因株系（PR IR-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ）中抗性植株的比例分別為2.5

7、％、3.0％、15.6％和4.3％；接種PVY-SD4和TEV-SD1則全部感病。結果顯示：當轉基因與病毒RNA序列間的同源性為100％-90.2％時，均可介導對病毒的抗性；同源性等于或低于88.2％時，則不能介導病毒抗性的產(chǎn)生。表明轉基因與病毒RNA序列間高度的同源是抗性產(chǎn)生所必需的，最低同源性在90％左右。同時發(fā)現(xiàn)，抗性與同源性并不呈完全正相關。表明區(qū)段的位置或序列對RNA介導的病毒抗性產(chǎn)生也有影響。為了分析轉基因的拷貝數(shù)與抗病性的

8、關系，對獲得的抗病轉基因植株和部分感病轉基因植株進行Southern雜交分析，結果表明，外源基因己整合到煙草基因組中，且轉基因植株的抗病性與轉基因的拷貝數(shù)之間無明顯的相關性。轉基因植株的Northern雜交分析表明，轉基因都在RNA水平上得到了表達，抗病植株中RNA的積累量明顯低于同類型的感病植株，抗性與RNA積累量呈負相關；抗病轉基因植株中有siRNA存在，表明病毒抗性是由RNA介導的。
　　 根據(jù)已克隆的PVY-SD5 NI

9、b的全長cDNA序列（1557bp）設計了5個不同位置，5'端（nt1-51）、5'端1/2（nt364-414）、中間（nt753-803）、3'端1/2（nt1143-1193）和3'端（nt1507-1557）基因片段的特異引物，以PVY-SD5 NIb的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到51bp的基因擴增產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物雙酶切后，用T4DNA連接酶于16℃體外連接，熱激法轉化大腸桿菌DH5α。篩選并獲得重組表達質粒pRIR-N

10、IbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ。酶切鑒定表明成功構建了植物表達載體。將成功構建的植物表達載體利用凍融法直接導入農(nóng)桿菌LBA4404，葉盤法轉化煙草NC89。轉化pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ的轉基因植株經(jīng)卡那霉素篩選和PCR檢測，分別獲得61、58、64、67和56株T0代轉基因植株。轉基因植株的抗病性分析表明：P

11、VY NIb基因不同位置cDNA區(qū)段介導的對PVY的抗性存在顯著差異，轉pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ株系中，抗病植株的比例分別為31.15％、10.34％、51.56％、67.16％和16.07％。通過對轉基因植株的Northern雜交分析表明，轉基因都在RNA水平上得到了表達，抗病植株中RNA的積累量明顯低于同類型的感病植株，抗性與RNA積累量呈負相關；抗病轉基因植