dsRNA介導的煙草抗黃瓜花葉病毒(CMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)研究.pdf

1、RNA沉默是植物體內固有的一種抗病毒防衛(wèi)反應，而大多數(shù)植物病毒編碼的RNA沉默抑制子可以克服這種寄主的防衛(wèi)反應。本研究利用轉錄后基因沉默原理，分別構建含沉默抑制子CMV2b基因、PVY HC-Pro基因部分片斷以及融合2b和HC-Pro基因部分片段反向重復的植物表達載體，通過在植物體內形成dsRNA沉默目標基因2b和HC-Pro，獲得了單獨抗CMV、單獨抗PVY以及雙抗CMV和PVY的云煙85轉基因煙草植株，明確了dsRNA介導的轉基因

2、抗病毒基因工程策略的可行性。
　　 1. CMV2b基因的克隆和序列分析
　　 從安徽亳州采集表現(xiàn)明顯CMV癥狀的煙草樣本，RT-PCR擴增CMV RNA2部分片段，克隆并測序。其中包含的2b基因全長336個核苷酸，編碼111個氨基酸。序列比對表明，來源于安徽煙草的CMV2b基因與來源于韓國的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高，達98.8％。構建2b基因系統(tǒng)關系樹，也表明來源于安徽煙草的CMV2b基因與AF0

3、33667親緣關系最近。
　　 2．反向重復植物表達載體的構建
　　 1)2b基因部分片斷反向重復表達載體的構建
　　 以安徽CMV2b為模板，分別擴增大小約為300 bp的正向片段2b(r)和反向片段2b(i)。先后將反向片段2b(i)和正向片段2b(r)分別插入載體pSK-In所含intron兩側，獲得重組質粒pSK-2b(r)-In-2b(i)。再將含intron的正反向片段插入pBIN438，最終得到含2

4、b部分序列反向重復的植物表達載體pBIN-2b(r)-In-2b(i)。
　　 2) HC-Pro基因部分片段反向重復表達載體的構建
　　 （見陳偉論文）
　　 3)融合2b和HC-Pro基因部分片段反向重復表達載體的構建
　　 將HC-Pro基因部分序列反向重復片段插入質粒pBrN-2b(r)-In-2b(i)，最終獲得同時含2b和HC-Pro基因反向重復片段的重組質粒pBIN-2b(r，i)-HC(r

5、，i)。
　　 3．轉基因陽性煙草植株的獲得
　　 3種植物表達載體pBIN-2b(r)-In-2b(i)、pBIN-HC(r-In-HC(i)和pBIN-2b(r,i)-HC(r，i)分別轉化農桿菌EHA105，葉盤法轉化煙草(Nicoiiana tabacum)品種云煙85，經(jīng)預培養(yǎng)、農桿菌浸潤、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，最終獲得3種卡那抗性再生植株。對抗性再生植株進行PCR檢測，獲得了轉2b基因、HC-Pro基因以及融合