表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白重組沙門(mén)氏菌的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒（Porcine eircovirus type2，PCV2）是當(dāng)前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。該病毒與豬的多種疾病綜合征有關(guān)，特別是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，隨后以極高的感染率迅速在全球蔓延流行，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、蒼白及黃疸等。PCV2在豬群中的感染率非常高，但多為隱性感染，該病主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，造成繼發(fā)感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成

2、巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)本病的預(yù)防除加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、搞好環(huán)境衛(wèi)生和減少應(yīng)激外，最主要的途徑就是依靠疫苗，因此，研制安全、高效、制備方便和廉價(jià)的新型基因工程疫苗成為越來(lái)越多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 本研究對(duì)PCV2新型疫苗進(jìn)行了新的探索，構(gòu)建了利用豬霍亂沙門(mén)氏菌載體系統(tǒng)表達(dá)Cap蛋白的重組菌，利用重組菌對(duì)小鼠進(jìn)行了免疫學(xué)效力研究，主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1．豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白單克隆抗體的制備
　　 利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建

3、的PCV2-ORF2重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到融合蛋白GST-Cap，采用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行純化，并作為免疫原采取常規(guī)皮下免疫與尾靜脈沖擊免疫結(jié)合的方式免疫BALB/c小鼠。取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）篩選，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，經(jīng)過(guò)3次克隆后獲得了2株抗Cap蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3E5和4H8。Western-blot和間接免疫熒光結(jié)果顯示3E5和

4、4H8株單克隆抗體能與Cap蛋白和PCV2發(fā)生特異性反應(yīng)。其抗體亞類(lèi)類(lèi)型分別為IgG2a和IgG2b，輕鏈為κ型，細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)均為1：1024，小鼠腹水效價(jià)分別為1：409600和1：204800。這2株單抗的獲得為進(jìn)一步研究PCV2-ORF2基因的功能及建立準(zhǔn)確快速診斷PCV2的方法提供了強(qiáng)有力的手段。
　　 2．表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白重組沙門(mén)氏菌的構(gòu)建及鑒定
　　 根據(jù)GenBank中的已知序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物

5、，分別擴(kuò)增PCV2-ORF2全基因和去核定位序列的ORF2基因，然后將兩個(gè)片段分別亞克隆至含asd+基因及β-lactamase信號(hào)序列的原核表達(dá)質(zhì)粒pYA3493中，得到重組質(zhì)粒pYA-ORF2和pYA-△41ORF2。將pYA-ORF2、pYA-△41ORF2和pYA3493分別電轉(zhuǎn)化豬霍亂沙門(mén)氏菌C500的asd缺失株C501中，制備重組菌株C501（pYA-ORF2）、C501（pYA-△41ORF2）和空載體菌株C501（pY

6、A3493）。SDS-PAGE鑒定表明，去核定位信號(hào)的ORF2基因可以表達(dá)，而含全基因序列的ORF2基因未表達(dá)。Western-blot結(jié)果表明：去核定位信號(hào)的ORF2基因表達(dá)的蛋白可以與抗PCV2-ORF2單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。研究結(jié)果表明，重組菌株C501（pYA-△41ORF2）不僅保留了親本菌株C500的表型特征，且能穩(wěn)定遺傳并分泌表達(dá)外源蛋白。將5.9×10 CFU的重組菌C501（pYA-△41ORF2）分別以口服和肌肉