鐵蛋白與圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白重組蛋白(F-Cap)表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)等相關(guān)疾病的重要病原。該病已在全球各地區(qū)的豬群中廣泛分布，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種是當(dāng)前防控該病傳播的有效措施之一。市場(chǎng)上現(xiàn)有圓環(huán)病毒疫苗只能一定程度上控制豬群圓環(huán)病毒病的陽(yáng)性率和緩和陽(yáng)性豬群的臨床癥狀，不能從上根本阻斷病原的傳播。
　　鐵蛋白（ferritin，F(xiàn)），廣泛分布在各種生物體中，其主

2、要作用是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)鐵離子含量，為生物體營(yíng)造一個(gè)平衡的鐵離子環(huán)境。由于其具有可以自組裝成殼狀納米結(jié)構(gòu)和易被機(jī)體降解吸收的特性，常被用于藥物遞送載體、醫(yī)學(xué)造影成像診斷、納米生物傳感器等領(lǐng)域。此外，有研究表明轉(zhuǎn)鐵蛋白由于其內(nèi)部羧基端和外部環(huán)狀結(jié)構(gòu)都有潛在的位點(diǎn)供各種各樣的多肽和小蛋白抗原插入，所以可以作為一個(gè)從基因角度引入多肽類(lèi)抗原至其內(nèi)部或外部的納米蛋白遞呈系統(tǒng)。本研究擬構(gòu)建F-Cap重組表達(dá)載體，驗(yàn)證Cap蛋白與鐵蛋白融合表達(dá)的效果，并

3、探索重組蛋白的理化性質(zhì)和生物活性等，為下一步新型高效疫苗的研發(fā)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本研究首先對(duì)帶促溶標(biāo)簽的若干表達(dá)載體和F-Cap基因多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列進(jìn)行分析，從中選擇6種促溶效果較好的載體，設(shè)計(jì)BamHⅠ和XhoⅠ兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)用于重組蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建；運(yùn)用PCR和酶切的方法獲得F-Cap目的基因片段后，用T4連接酶將目的基因與6個(gè)帶不同標(biāo)簽的相同酶切載體相連，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒；對(duì)相應(yīng)的重

4、組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，然后對(duì)酶切鑒定成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行基因序列測(cè)定，測(cè)序鑒定成功后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，對(duì)有表達(dá)的細(xì)菌進(jìn)行超聲破碎，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳二次鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6種重組質(zhì)粒都有目的蛋白表達(dá)，其中有3種重組質(zhì)粒所表達(dá)的目的蛋白主要集中在上清中。
　　利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行親和純化，TEV酶切，去掉重組蛋白親和標(biāo)簽，獲