靶向PRRSV及其PAM細(xì)胞病毒受體基因shRNA重組腺病毒的構(gòu)建與抑制PRRSV復(fù)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）為有囊膜的單鏈正股RNA病毒，屬于尼多病毒目動脈炎病毒科，主要引起母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)等繁殖障礙，仔豬、育肥豬呼吸困難及育成豬類流感疾病，并可持續(xù)性感染，引起免疫抑制，已經(jīng)成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)安全的重要病原之一。
　　 RNA干擾（RNAi）是由小干擾RNA（small interference RN

2、A,siRNA）引發(fā)的信使RNA（mRNA）序列特異性消減現(xiàn)象，在真核生物細(xì)胞具有基因表達(dá)調(diào)控的作用，同時(shí)又是一種保守的抗病毒機(jī)制.siRNA是19-27nt的小分子雙鏈RNA片段，可以由體外轉(zhuǎn)錄或載體DNA轉(zhuǎn)錄的發(fā)夾RNA(short hairpin RNAs,shRNAs)得到。siRNA可以抑制同源的內(nèi)源或病原mRNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室利用pSUPER質(zhì)粒介導(dǎo)PRRSV特異性shRNA可以有效抑制病毒在MARC-145中的復(fù)制增殖.

3、
　　 本研究構(gòu)建了表達(dá)靶向PRRSV不同基因和不同病毒受體基因shRNA的表達(dá)質(zhì)粒及重組腺病毒，并在體外和體內(nèi)對表達(dá)的shRNA抑制病毒復(fù)制和目的基因表達(dá)的效果進(jìn)行了評價(jià)。本研究內(nèi)容分為以下6個部分：
　　 1.PRRSV基因SYBR Green real-time PCR檢測方法的建立
　　 針對PRRSV S1株和SY0608株的ORF1b基因設(shè)計(jì)了real-time PCR引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了r

4、eal-time PCR檢測ORF1b基因表達(dá)水平的方法。結(jié)果表明，建立的real-time PCR方法具有很好的敏感性、特異性和重復(fù)性，對PRRSV細(xì)胞培養(yǎng)物的檢測下限為10～100TCID50。
　　 2.靶向ORF1b shRNA重組質(zhì)粒在MARC-145細(xì)胞對PRRSV復(fù)制的抑制作用
　　 將靶向PRRSV ORF1b shRNA的重組質(zhì)粒pSUPER-P2和pSUPER-P3分別轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，24h

5、后再感染相同劑量PRRSV，感染PRRSV48h或72h.采用TCID50,real-time PCR和IFA方法分別檢測shRNA重組質(zhì)粒對PRRSV復(fù)制的抑制效果，探明抑制機(jī)制。結(jié)果為，MARC-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSUPER-P2或 pSUPER-P3后，接種PRRSV細(xì)胞病變(CPE)明顯減輕，病毒TCID50滴度比PRRSV對照組細(xì)胞中的病毒量降低了約100倍；PRRSV ORF1b mRNA和ORF1b蛋白水平比對照明顯降低(p

6、＜o(jì).05)。證明靶向ORF1基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒能夠在MARC-145細(xì)胞中有效抑制PRRSV的復(fù)制。
　　 3.靶向PRRSV不同基因的shRNA重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　 將重組pSUPER（pSUPER-N3，pSUPER-G1,pSUPER-P2和pSUPER-P3）質(zhì)粒中的PH1-shRNA表達(dá)框經(jīng)PCR擴(kuò)增后，隆入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMVPCMV啟動子下游，重組穿梭載體測序鑒定后，與腺病

7、毒骨架載體共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，獲得shRNA腺病毒重組載體。再將重組腺病毒載體經(jīng)PacI線性化后轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，獲得表達(dá)針對PRRSV不同閱讀框shRNA的重組腺病毒rAd-N3(ORF7),rAd-G1(ORF5),rAd-P2( ORF1b)和rAd-P3(ORF1b)。同時(shí)構(gòu)建了表達(dá)突變shRNA的重組腺病毒rAd-mN3和rAd-mP2，作為腺病毒對照，重組腺病毒接種HEK-293A細(xì)胞后72h出現(xiàn)CPE，熒

8、光顯微鏡檢查有GFP。重組病毒滴度均為10i0～1011efu/mL。PCR檢測重組腺病毒基因組內(nèi)PH1-shRNA表達(dá)框均為陽性。
　　 4.靶向PRRSV不同基因的shRNA重組腺病毒在體外抑制PRRSV復(fù)制的效果的比較
　　 為驗(yàn)證上述構(gòu)建的表達(dá)shRNA的重組腺病毒(rAd-shRNA)是否能夠有效抑制PRRSV的復(fù)制，在MARC-145細(xì)胞上先別接種500MOI的rAd-shRNA,24小時(shí)后感染10MOI的P

9、RRSV S1株；感染PRRSV48小時(shí)后，觀察PRRSV引起的CPE程度，并測定PRRSV的滴度；利用PRRSVN蛋白和ORF1b蛋白單克隆抗體及GP5蛋白多抗，采用間接免疫熒光(IFA)的方法檢測蛋白含量，用real-time PCR的方法檢測與shRNA對應(yīng)的基因水平。結(jié)果表明：(1)shRNA重組腺病毒組CPE明顯減輕，TCID50滴度明顯低于rAd-mN3對照組(p＜0.05)i(2)與對照組相比PRRSV ORF7和ORF1

10、b基因均被其特異性的shRNA抑制了至少100倍：(3)PRRSVN蛋白，GP5蛋白以及ORF1b蛋白的表達(dá)量與接種rAd-mN3及只感染PRRSV的對照組相比顯著下降。該結(jié)果證明本研究構(gòu)建的rAd-shRNA可以有效抑制PRRSV在MARC-145細(xì)胞中的復(fù)制。
　　 為了進(jìn)一步研究rAd-shRNA是否能在PAM原代細(xì)胞中抑制PRRSV復(fù)制，在PAM細(xì)胞上，按照上述方法接種同樣劑量的rAd-shRNA和PRRSV，感染PRR

11、SV48小時(shí)，先觀察CPE，用N蛋白單抗檢測病毒含量的同時(shí)采用real-timePCR的方法分別檢測細(xì)胞中N蛋白基因的水平，并測定病毒滴度。結(jié)果證明：(1)與對照組比，4個靶向PRRSV不同基因shRNA的重組腺病毒，均可以在PAM中有效抑制PRRSVS1株的復(fù)制，抑制效力為100～1000倍左右；(2)shRNAs對PRRSV的復(fù)制抑制作用隨著時(shí)間的延長而逐漸減弱；(3)shRNAs對PRRSV的復(fù)制抑制作用具有明顯的劑量依賴性，即抑

12、制效力隨著rAd-shRNA接種劑量的增加而增強(qiáng)；(4)PAM感染PRRSV后再接種rAd-shRNA或同時(shí)感染兩種病毒時(shí)，rAd-N3、rAd-G1、rAd-P2和rAd-P3仍然能夠有效地抑制病毒復(fù)制.
　　 5.靶向PRRSV ORF1b的shRNA重組腺病毒在體內(nèi)外抑制高致病性PRRSV復(fù)制抑制效果研究
　　 選取靶向PRRSV ORF1b的2個重組腺病毒，按上述同樣方法在MARC-145細(xì)胞上觀察其抑制PRRS

13、V傳統(tǒng)毒株S1和高致病性毒株SY0608復(fù)制效果.結(jié)果表明，與表達(dá)突變shRNA的rAd-mP2對照組以及PRRSV接毒對照組相比，rAd-P2對S1株和SY0608株的復(fù)制均具有明顯的抑制作用：而rAd-P3只能有效抑制S1株復(fù)制，對SY0608株的抑制作用不明顯.
　　 選取PRRSV陰性豬，制備PAM細(xì)胞，用上述同樣方法進(jìn)一步觀察rAd-P2抑制SY0608株復(fù)制效果.結(jié)果顯示，rAd-P2可以有效抑制PRRSV細(xì)胞病變的

14、產(chǎn)生；與對照相比，PRRSV N蛋白以及細(xì)胞內(nèi)ORF1b mRNA水平均明顯降低(p＜0.05)，且該抑制作用具有劑量依賴性，并隨時(shí)間的延長逐漸減弱.
　　 選取20頭6周齡PRRSV陰性仔豬，分成4組，每組5頭.第1和2組分別肌肉注射rAd-P2和rAd-mP2，4×109TCID50/頭，24小時(shí)后第1～3組分別肌肉注射PRRSV SY0608株（2×104.0 TCID50/頭），第4組作為正常對照：接種后隔離飼養(yǎng)觀察，每

15、日測量體溫和采血。接種PRRSV后第9天，將所有豬只宰殺，進(jìn)行病理學(xué)觀察和PRRSV real-time PCR檢測。結(jié)果為，(1)臨床癥狀：rAd-mP2組和攻毒對照動物，攻毒后第3天起出現(xiàn)體溫升高（40.0～42℃），并出現(xiàn)食欲不振，嗜睡，呼吸困難，皮膚發(fā)紅，眼瞼水腫，輕微腹瀉和背毛雜亂等臨床癥狀，而rAd-P2組的動物攻毒后第6天才出現(xiàn)體溫升高，癥狀輕于對照組(40.0～41℃)，在攻毒后第8天，3頭動物出現(xiàn)輕微的臨床癥狀：(2)

16、病理學(xué)觀察：rAd-P2組動物的肺部病變明顯輕于對照組動物，其中只有3頭豬的肺有輕微的間質(zhì)性肺炎，其余兩頭豬肺外觀無明顯病理損傷。肺組織病理切片觀察顯示，rAd-mP2組和攻毒對照組動物的肺組織出現(xiàn)明顯的間質(zhì)性肺炎，如肺泡壁增厚，單核巨噬淋巴細(xì)胞浸潤和支氣管滲出物增多，而rAd-P2組僅3頭動物肺組織出現(xiàn)了輕微的微觀病理損傷；(3)病毒血癥：對攻毒后第1天和第5天的血清中病毒含量檢測，結(jié)果顯示，攻毒后第5天時(shí)rAd-P2組動物的病毒血癥

17、與對照組相比，被明顯抑制(p＜0.05)；(4)肺組織中PRRSV檢測：rAd-P2組動物肺組織中病毒的平均含量同樣明顯低于對照組(p＜0.05)。
　　 6.表達(dá)靶向PRRSV受體基因shRNA重組質(zhì)粒和重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　 根據(jù)CD151、CD163和CD169（唾液酸黏附素）的基因序列分別設(shè)計(jì)引物，將擴(kuò)增的基因片斷克隆于pEGFP-N1載體，獲得3個EGFP融合表達(dá)質(zhì)粒。并以CD151、CD163和CD16

18、9基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)合成具有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核酸序列，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈后，克隆于pSUPER質(zhì)粒中；利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PH1-shRNA表達(dá)框，再克隆入重組腺病毒載體，獲得表達(dá)shRNA的重組腺病毒rAd-151-1和rAd-151-2，rAd-163-1和rAd-163-2、rAd-169-1和rAd-169-2。將shRNA重組質(zhì)粒與構(gòu)建的融合表達(dá)質(zhì)粒兩兩共轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)觀察熒光表達(dá)情況。結(jié)果shRNA