肝癌靶向SEA-CD80共表達(dá)重組腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)的肝癌患者約45％發(fā)生在我國(guó)大陸地區(qū)，而且近年來(lái)發(fā)病率又有增高趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)表明我國(guó)肝癌的年死亡率為20.40/10萬(wàn)，在城市和農(nóng)村分別占惡性腫瘤死亡率的第一和第二位。現(xiàn)有的手術(shù)方法不能完全切除癌細(xì)胞；放、化療等傳統(tǒng)方法也不利于癌癥的徹底治療。隨著腫瘤生物治療技術(shù)的不斷發(fā)展，基因治療作為肝癌生物治療的一個(gè)重要手段越來(lái)越受到重視。充分發(fā)揮機(jī)體的自身力量，如免疫功能治療癌癥是一條具有十分廣闊前景

2、的“綠色通道”?；蛑委熢谶M(jìn)入臨床應(yīng)用前必須解決組織和細(xì)胞特異性問(wèn)題，以減少副作用。此外，由于肝癌細(xì)胞免疫原性弱，MHC分子、表面共刺激分子表達(dá)低下或缺乏，以及抑制自體腫瘤免疫等因素，現(xiàn)有的免疫治療往往不能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，致使癌細(xì)胞能夠逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊。超抗原無(wú)需抗原遞呈細(xì)胞的加工，而是以完整的蛋白分子直接與抗原遞呈細(xì)胞的MHC-II及T細(xì)胞受體（TCR）結(jié)合，從而激活大量的T細(xì)胞。金黃色葡萄球菌腸毒素A作為一種超抗原物質(zhì)，

3、應(yīng)用于人類(lèi)腫瘤治療已有報(bào)道。CD80是一個(gè)重要的輔助刺激分子，通過(guò)與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合提供細(xì)胞活化所需的第二信號(hào)，刺激T細(xì)胞活化。
　　在本研究中，我們以AFP啟動(dòng)子和增強(qiáng)子為調(diào)控元件、以共表達(dá)CD80和穿膜型葡萄球菌腸毒素A基因?yàn)槟康幕?，以Ad5腺病毒為載體構(gòu)建了以AFP為肝癌靶向調(diào)控SEA/CD80共表達(dá)的重組腺病毒，為肝癌的免疫基因治療的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　1.攜帶人AFP啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的腺病毒穿梭

4、質(zhì)粒的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建甲胎蛋白（AFP）啟動(dòng)子/增強(qiáng)子基因調(diào)控的腺病毒穿梭載體。方法：設(shè)計(jì)相關(guān)引物，利用實(shí)驗(yàn)室保存的人肝基因組DNA為模板，經(jīng)PCR方法，獲得AFP基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子片段。利用本實(shí)驗(yàn)室之前改建好的pShuttle2穿梭載體，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒等步驟構(gòu)建目的穿梭載體pShuttle-AFP。結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定和基因測(cè)序等方法鑒定，所克隆的AFP啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列與Genebank中公布的相關(guān)序列一致。酶切鑒定

5、結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。結(jié)論：我們成功構(gòu)建了攜帶AFP啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-AFP，為下一步肝癌特異性調(diào)控治療基因的構(gòu)建做好基礎(chǔ)。
　　2.AFP增強(qiáng)子和啟動(dòng)子調(diào)控的SEA-CD80共表達(dá)腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建AFP增強(qiáng)子和啟動(dòng)子調(diào)控的SEA-CD80基因共表達(dá)穿梭腺病毒載體。方法：首先設(shè)計(jì)SEA和CD80目的片段的引物，分別以葉菁博士構(gòu)建的pMD18-tmSEA載體和人肝cDNA為模板，

6、經(jīng)PCR方法獲得穿膜型SEA（tmSEA）和CD80的目的基因片段；將tmSEA片段連接入pIRES2-EGFP載體，構(gòu)建pIRES2-EGFP-SEA。利用免疫熒光方法檢測(cè)穿膜型SEA的亞細(xì)胞定位。將CD80片段連接入pMD18-T載體，分別經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化等步驟構(gòu)建pMD18-T-CD80，構(gòu)建完成的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確的質(zhì)粒送生物公司測(cè)序。將測(cè)序正確的pMD18-T-CD80質(zhì)粒經(jīng)雙酶切，取得CD80目的片段。測(cè)序正確的pIRES2-E

7、GFP-SEA質(zhì)粒經(jīng)雙酶切，獲得SEA-IRES片段與CD80克隆到pShuttle-AFP載體，構(gòu)建目的載體pShuttle-AFP-SEA-CD80。結(jié)果：所克隆的SEA和CD80序列與Genebank中公布的相關(guān)序列一致。所有的酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。以構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒為模板，所有片段的引物為相關(guān)引物，PCR得到的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。同時(shí)，利用免疫熒光確定穿膜型SEA能夠定位到細(xì)胞膜表面。結(jié)論：我們成功構(gòu)建了以AFP基因?yàn)榘邢蛘{(diào)控

8、的SEA-CD80基因共表達(dá)真核腺病毒載體。
　　3.肝癌靶向SEA-CD80共表達(dá)重組腺病毒的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建AFP基因調(diào)控的SEA-CD80基因共表達(dá)重組腺病毒。方法：采用AdEasyTM腺病毒制備系統(tǒng)將實(shí)驗(yàn)二中構(gòu)建的穿梭載體pShuttle-AFP-SEA-CD80經(jīng)PmeI單酶切線(xiàn)性化后，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化E.coliBJ5183。構(gòu)建pAd-AFP-SEA-CD80重組腺病毒質(zhì)粒。采用Pa

9、cI線(xiàn)性化pAd-AFP-SEA-CD80，轉(zhuǎn)染AD293包裝細(xì)胞，獲得由AFP增強(qiáng)子和啟動(dòng)子調(diào)控的共表達(dá)SEA和CD80的重組腺病毒，并擴(kuò)增。將腺病毒感染表達(dá)AFP的HepG2細(xì)胞，利用Westernblot檢測(cè)目的基因的表達(dá)。結(jié)果：所構(gòu)建的pAd-AFP-SEA-CD80重組腺病毒載體，經(jīng)PacI酶切鑒定獲得大小為3.5kDa和4.5kDa的預(yù)期目的片段，以重組載體為模板，所有片段的引物為相關(guān)引物，PCR得到的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。該

10、腺病毒感染肝細(xì)胞癌HepG2后，能夠特異性地檢測(cè)到目的基因tmSEA和CD80的表達(dá)。結(jié)論：我們成功構(gòu)建了以AFP啟動(dòng)子/增強(qiáng)子為靶向調(diào)控的SEA-CD80基因共表達(dá)重組腺病毒載體，并能夠在HepG2細(xì)胞中特異性地表達(dá)目的基因tmSEA和CD80。為肝癌特異性調(diào)控免疫基因治療劑的制備奠定基礎(chǔ)。
　　本研究成功的從人肝基因組DNA中克隆到人甲胎蛋白（AFP）的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，成功構(gòu)建了AFP啟動(dòng)子順式調(diào)控序列調(diào)控的腺病毒穿梭質(zhì)粒

11、pShuttle-AFP；成功地構(gòu)建了穿膜型SEA，克隆了CD80基因，并將二者克隆到構(gòu)建的pShuttle-AFP，成功構(gòu)建了pShuttle-AFP-SEA-CD80穿梭質(zhì)粒；采用AdEasyTM腺病毒制備系統(tǒng)將構(gòu)建好的pShuttle-AFP-SEA-CD80穿梭載體，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行重組，構(gòu)建pAd-AFP-SEA-CD80重組腺病毒載體。利用包裝細(xì)胞，制備了AFP啟動(dòng)子調(diào)控的共表達(dá)穿膜型SEA和CD80分