生長抑素DNA疫苗免疫小鼠的基因表達與免疫應(yīng)答規(guī)律研究.pdf

1、生長抑素是由下丘腦分泌的一種神經(jīng)多肽，能抑制GH釋放進而抑制動物生長。目前本實驗室已完成生長抑素DNA疫苗的構(gòu)建工作并用于臨床試驗，本實驗采用器官成像、冰凍切片、免疫組化等檢測手段研究以減毒沙門氏菌為載體的無抗性生長抑素基因疫苗C500（pGS/2SS-M4GFP-asd）免疫后小鼠的基因表達與免疫應(yīng)答規(guī)律，旨在探索生長抑素基因疫苗對小鼠的免疫應(yīng)答持續(xù)時間、免疫應(yīng)答產(chǎn)生部位等，為后續(xù)的臨床動物實驗以及將來的生產(chǎn)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

2、　　 整個實驗分為以下3個部分：
　　 1.抗生長抑素抗體檢測。
　　 取54只3周齡Balb/C小鼠及90只7周齡昆明小鼠，各分為S、C和P組，實驗S組免疫非抗性pGS/2SS-M4GFP-asd疫苗，陰性對照C組免疫C500空菌，空白對照P組免疫PBS溶液。分別檢測免疫后不同時間段的血漿生長抑素抗體水平，結(jié)果顯示：Balb/C小鼠免疫后13d；昆明小鼠免疫后9d，實驗組抗體水平顯著上升。提示小鼠免疫生長抑素基因疫苗

3、后，能夠產(chǎn)生針對于生長抑素的特異性抗體，表明有望通過免疫中和途徑降低血漿中生長抑素濃度，從而可以起到促生長的作用。
　　 2.器官表達。
　　 通過熒光顯微鏡觀察融合目的基因M4GFP轉(zhuǎn)染PK細胞成功后，將帶有增強型綠色熒光蛋白（M4GFP）報告基因的生長抑素基因疫苗C500（pGS/2SS-M4GFP-asd）免疫小鼠，12小時后開始宰殺試驗組和對照組取器官進行熒光成像實驗。預(yù)實驗中實驗組肝臟組織、脾臟組織、腎臟組織、

4、肌肉組織在免疫后48h與對照組相比較出現(xiàn)特異性綠色熒光，表明目的蛋白可以在小鼠體內(nèi)表達，且用綠色熒光蛋白標記生長抑素基因疫苗進行實時觀察是可行的。
　　 3.組織表達。
　　 免疫后宰殺試驗組和對照組小鼠取肝臟、肌肉和脾臟等組織器官制備冰凍切片，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白基因在組織器官中的表達情況。在熒光顯微鏡下可以觀察到實驗組與對照組肌肉、心臟、肝臟等組織中均出現(xiàn)綠色熒光，提示采用綠色熒光蛋白標記法檢測目的基因在小鼠

5、體內(nèi)的表達，會受到體內(nèi)自發(fā)熒光的影響，造成假陽性綠色熒光的出現(xiàn)。
　　 應(yīng)用免疫組化方法，肌肉注射攜帶生長抑素質(zhì)粒的減毒沙門氏菌后，小鼠肝臟組織、腿部肌纖維組織、脾臟組織在免疫后5d的組織化學(xué)切片中可見有特異性棕黃色陽性產(chǎn)物出現(xiàn)，說明減毒沙門氏菌作為載體能夠?qū)⒅亟M真核表達質(zhì)粒帶入小鼠內(nèi)臟器官中，同時外源基因（SS）得到表達。
　　 本研究成功轉(zhuǎn)化了生長抑素基因的真核表達載體，并證實以減毒沙門氏菌為載體的生長抑素基因疫苗免