新型生長(zhǎng)抑素DNA疫苗免疫豬的效果及其影響因素和作用機(jī)制研究.pdf

1、本研究應(yīng)用基因免疫、酶聯(lián)免疫測(cè)定、活體成像和石蠟切片等技術(shù)，將新型生長(zhǎng)抑素DNA疫苗--減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌株CS022(pGM-CSF/SS)口服和鼻腔免疫仔豬，探討其免疫效力及影響因素；另將減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌株C500(pGS/2SS-M4GFP-asd)肌肉注射小鼠，探討外源目的基因在組織器官中表達(dá)與分布的時(shí)空變化規(guī)律，為優(yōu)化新型DNA疫苗的免疫程序，提高其對(duì)仔豬的促生長(zhǎng)效果，加快其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 1.仔豬口服新型

2、生長(zhǎng)抑素DNA疫苗的免疫應(yīng)答及其促生長(zhǎng)效果
　　 為了探索疫苗能否誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)及其促生長(zhǎng)效果，將40只9周齡的杜-長(zhǎng)-大三元雜交豬隨機(jī)分為4組，每組10只，公母各半。第1～3組(T1-T3)經(jīng)口灌服低(5×108 CFU/只)、中(5×109CFU/只)、高(5×1010 CFU/只)三個(gè)劑量的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌株CS022(pGM-CSF/SS)生長(zhǎng)抑素DNA疫苗，第4組灌服5ml PBS溶液，用做對(duì)照(C1)。1

3、W后以相同方式和劑量加強(qiáng)免疫1次。分別在免疫前、初免后4W、初免后8W稱(chēng)重3次；于免疫前及免疫后SW2次前腔靜脈采集血樣，用間接ELISA法檢測(cè)血漿IgG抗體水平，用放射免疫法檢測(cè)血漿中的SS濃度。
　　 結(jié)果顯示，免疫后仔豬行為正常，受試豬血漿中均能檢測(cè)到SS抗體，以T3組抗體水平最高；與C1組相比，T1組(P>0.05)差異不顯著，T2組(p<0.01)差異極顯著，T3組(p<0.01)差異極顯著。T3組與T1組相比(p<0

4、.01)，差異極顯著。試驗(yàn)各組出現(xiàn)的免疫陽(yáng)性豬比例，其中T1、T2組均為10.0%，T3組為40.0%。試驗(yàn)各組血漿SS濃度與免疫前和C1組相比均大大降低(P<0.01)，差異極顯著，但組間差異不顯著。
　　 免疫后0～4W，仔豬日增重T3組比C1組提高20.69%(P<0.05)，差異顯著，比T1組提高27.59%(P<0.01)，差異極顯著，比T2提高13.79%(P>0.05)，差異不顯著；T2組分別比C1組、T1組提高6

5、.90%、13.80%(P>0.05)，差異不顯著。免疫后5～8W，仔豬日增重T1組比C1組提高11.11%(P>0.05)，T2組和T3組比C1組均提高2.47%(P>0.05)，差異不顯著。免疫后0～8W，仔豬平均日增T3組比C1、T2、T1組分別提高10.00%、5.71%、7.14%(P>0.05)，差異不顯著。
　　 以上結(jié)果表明，新型生長(zhǎng)抑素DNA疫苗可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生高水平免疫應(yīng)答反應(yīng)，有效促進(jìn)了仔豬生長(zhǎng)；免疫后仔豬S

6、S抗體水平、抗體陽(yáng)性豬所占比率和平均日增重均與免疫劑量存在正相關(guān)關(guān)系。
　　 2.仔豬鼻腔免疫新型生長(zhǎng)抑素DNA疫苗的促生長(zhǎng)效果
　　 為了探索鼻腔免疫新型生長(zhǎng)抑素DNA疫苗對(duì)仔豬的促生長(zhǎng)效果，將75只遺傳背景、年齡一致，體重21.0±2.0Kg杜長(zhǎng)大三元雜交閹公豬分成4組，前3組(T4～T6)每組20只，鼻腔免疫3次，每次間隔4W，劑量分別為低(2×108 CFU/只)、中(2×109CFU/只)、高(2×1010 C

7、FU/只)，第4組(C2)15只，鼻腔給藥PBS溶液，劑量為2ml，用做對(duì)照。分別在免疫前、免疫后12W稱(chēng)量體重。結(jié)果顯示，3個(gè)免疫組(T4～T6)平均日增重較對(duì)照組(C2)分別提高11.11%、6.17%、1.23%(P>0.05)，差異不顯著。隨著免疫劑量的升高，平均日增重呈下降趨勢(shì)，表明鼻腔免疫效果與劑量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。在日增重提升幅度一致情況下，鼻腔免疫需要的疫苗劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于口服免疫。
　　 3.新型生長(zhǎng)抑素DNA疫

8、苗肌肉注射小鼠后目的基因表達(dá)與蛋白分布的時(shí)空變化規(guī)律
　　 為了探索肌肉注射新型生長(zhǎng)抑素DNA疫苗小鼠器官組織SS融合蛋白的時(shí)空變化規(guī)律，將78只7周齡昆明小鼠隨機(jī)分為13組，每組6只，雌雄各半，采用肌肉縱向兩點(diǎn)注射法在小鼠2個(gè)后肢股四頭肌接種，劑量為150μL×109CFU/只。6個(gè)免疫組(A1～A6)免疫減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌C500(pGS/2SS-M4GFP-asd)生長(zhǎng)抑素DNA疫苗，6個(gè)陰性對(duì)照組(B1～B6)免疫不含質(zhì)

9、粒的C500空菌疫苗，1個(gè)組注射150μLPBS溶液，用于空白對(duì)照(C3)。分別于免疫后24 h、48h、96 h、144h、192h、240h6個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次用乙醚熏暈處死A1～A6和B1～B6組的6只小鼠，C4組小鼠于注射24h處死，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和后腿肌肉樣品制作石蠟切片，并用免疫組化法染色切片。
　　 結(jié)果顯示，僅在注射處肌肉、脾臟、肝臟組織中的巨噬細(xì)胞依次表達(dá)SS蛋白，并在144h到達(dá)峰值。肌肉組織最先