基因佐劑GM-CSF與生長(zhǎng)抑素共表達(dá)基因疫苗的構(gòu)建及其對(duì)仔豬的促生長(zhǎng)作用.pdf

1、本論文采用基因工程、分子生物學(xué)、細(xì)菌培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、ELISA、Western-blotting等技術(shù)，以pIPES為載體，分別將含有乙肝表面抗原的生長(zhǎng)抑素(SS)基因和粒細(xì)胞·巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)連接到載體的多克隆位點(diǎn)B和多克隆位點(diǎn)A上，從而同時(shí)表達(dá)這兩種蛋白，旨在研究該基因疫苗對(duì)仔豬的促生長(zhǎng)作用。
　　 從pVGS/2SS-asd基因上通過(guò)PCR的方法，分別獲得目的片段GM-CSF和2SS基因。將pIRES載

2、體的MCSA位點(diǎn)用NheⅠ和EcoRⅠ酶切開(kāi)，將GM-CSF片段插入。然后在MCSB位點(diǎn)用NotⅠ、SalⅠ酶切開(kāi)，將2SS基因片段插入其中。并將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pIRES-GM-CSF/2SS，獲得質(zhì)粒后，通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定基因的正確性，測(cè)序結(jié)果顯示基因序列完全正確。
　　 通過(guò)RT-PCR試驗(yàn)，確定GM-CSF蛋白和生長(zhǎng)抑素蛋白可以在RNA水平上表達(dá)，通過(guò)Western-blotting檢測(cè)，生長(zhǎng)抑素基因和GM-CSF基因

3、能在蛋白水平表達(dá)，從而確定該質(zhì)粒可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。
　　 選擇來(lái)源、體重相近的28日齡的杜×長(zhǎng)×大斷奶仔豬40頭隨機(jī)分為4個(gè)組，每組10頭，其中A組為對(duì)照組，B、C、D組為試驗(yàn)組、A組肌肉注射生理鹽水，試驗(yàn)組分別肌肉注射不同劑量的pIRES-GM-CSF/2SS基因疫苗，免疫劑量分別為0.25 mg、0.5 mg和1.0 mg，第一次免疫加入DDA佐劑，15 d后同樣劑量加強(qiáng)免疫1次，但沒(méi)有加入DDA佐劑。檢測(cè)仔豬的生長(zhǎng)抑素

4、抗體水平、仔豬增重和料重比等指標(biāo)，研究該基因疫苗對(duì)仔豬的促生長(zhǎng)作用。結(jié)果表明：
　　 1.pIRES-GM-CSF/2SS疫苗免疫后對(duì)仔豬的死亡率和腹瀉率的影響
　　 該疫苗經(jīng)過(guò)去內(nèi)毒素處理，免疫斷奶仔豬后，仔豬的死亡率和腹瀉率為0。
　　 2.對(duì)仔豬血漿中生長(zhǎng)抑素抗體的影響
　　 在試驗(yàn)第15 d，與對(duì)照組(A組)相比，B、C和D組的抗體水平分別提高了11.33％(P>0.05)、20.0％(P>0.0

5、5)和62.67％(P<0.05)，并隨著注射劑量的增加，抗體也有所提高。
　　 第30d，與對(duì)照組(A組)相比，B、C和D組的抗體水平分別提高了15.74％(P>0.05)、14.81％(P>0.05)和8.33％(P>0.05)，差異均不顯著。
　　 3.對(duì)仔豬增重的影響
　　 在注射疫苗0-15 d，與對(duì)照組相比，B、C和D組的日增重分別提高了35.88％(P<0.05)、21.17％(P>0.05)和25

6、.61％(P>0.05)。B、C和D組的料重比分別提高了16.67％、10.0％和4.67％。
　　 在試驗(yàn)的15-30 d，與對(duì)照組相比，B和C組的日增重有所降低，D組日增童提高了6.35％。B、C和D組料重比分別提高了5.06％、7.30％和3.37％。
　　 從全期來(lái)看，A、B、C和D組的日增重分別為491.00g、521.33 g、517.67 g和554.00g。與對(duì)照組相比，B、C和D組日增重分別提高了6.1

7、8％、5.43％和12.83％。A、B、C和D組的料重比分別為1.66、1.50、1.53、1.60，與對(duì)照組相比，B、C和D組料重比分別提高了9.64％、7.83％和3.61％。
　　 綜上所述，通過(guò)酶切和測(cè)序試驗(yàn)證明pIRES-GM-CSF/2SS基因疫苗的構(gòu)建是正確的；Western-blotting、ELISA試驗(yàn)證明基因疫苗的GM-CSF基因和SS基因可以在蛋白水平上表達(dá)；通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，這種基因疫苗可在一定程度提高仔豬