肌抑素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的影響及肌抑素和生長抑素免疫中效果研究.pdf

1、肌肉形成及其維持是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，受嚴(yán)密的機(jī)制調(diào)控，主要受激素、營養(yǎng)、生長因子、肌肉調(diào)節(jié)因子（MRFs）及運(yùn)動(dòng)的調(diào)控，這些因素相互作用形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究針對(duì)該網(wǎng)絡(luò)中的兩條最重要的軸:正向調(diào)控軸GH/IGF-1和負(fù)向調(diào)控軸肌抑素，通過免疫中和手段，初步研究了調(diào)控該兩條路徑后對(duì)小鼠肌形成過程及生長的影響，同時(shí)還初步探索了肌抑素在對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)控方面的新型功能。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.肌抑素對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分

2、泌的調(diào)控及其通路
　　 本實(shí)驗(yàn)表明在高脂日糧飼喂的小鼠肌肉、脂肪和脾臟中均可檢測(cè)到高水平肌抑素基因的表達(dá)，在脂肪和脾臟中同時(shí)還可以檢測(cè)到高水平的巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因F4/80和CD68的表達(dá);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在脾臟淋巴細(xì)胞可檢測(cè)到肌抑素的表達(dá)，并且LPS可增加脾臟淋巴細(xì)胞肌抑素的表達(dá)（可達(dá)259.37％，P=0.082）;而進(jìn)一步研究其對(duì)免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的影響發(fā)現(xiàn)，肌抑素主要可促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，而對(duì)樹突狀細(xì)胞

3、無顯著影響。肌抑素處理可顯著誘導(dǎo)骨髓來源巨噬細(xì)胞TNFα（最高可達(dá)545.71％，P=0.0011）、IL1β（最高可達(dá)14.97倍，P=0.039）、IL6(225.48％，P=0.012)等炎癥因子的表達(dá);對(duì)巨噬細(xì)胞系RAW264.7研究表明，小干擾RNA靶標(biāo)ActRIIB受體后，肌抑素誘導(dǎo)的TNFα的表達(dá)受到抑制（抑制了50.43％，P＜0.01），預(yù)示著在RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系中，肌抑素對(duì)TNFα的誘導(dǎo)表達(dá)是通過其Act

4、RIIB受體;同樣，小干擾RNA靶標(biāo)ActRIIB受體后，肌抑素誘導(dǎo)的IL1β的表達(dá)也受到抑制(抑制了79.18％，P=0.01)，因此肌抑素也是通過ActRIIB受體誘導(dǎo)IL1β的表達(dá);進(jìn)一步深入研究肌抑素誘導(dǎo)TNFα及IL1β表達(dá)所激活的信號(hào)通路途徑表明，肌抑素可能主要通過Smad（通路抑制劑可下調(diào)TNFα達(dá)51.72％，P=0.016）和JNK通路（通路抑制劑可下調(diào)TNFα達(dá)69.24％，P=0.0023）誘導(dǎo)TNFα的表達(dá)，而對(duì)

5、IL1β的誘導(dǎo)表達(dá)可能主要通過Smad、p38及Erk通路，各通路抑制劑可分別下調(diào)IL1β達(dá)58.21％(P＜0.01)、55.64％(P=0.002)及37.8％(P＜0.05)。
　　 2.免疫中和生長抑素
　　 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建、表達(dá)及純化GM-CSF/SS和CTB/SS重組融合蛋白，分別免疫雌性BALB/c小鼠，與pBS組相比，GM-CSF/SS可顯著增加免疫小鼠的體重4.62％(P＜0.05)，誘導(dǎo)高水平的抗生長抑素

6、抗體的產(chǎn)生，同時(shí)該處理組血清生長激素水平顯著增加了44.54％(P＜0.05)，相應(yīng)的肌肉IGF-1 mRNA表達(dá)水平增加了94％;而CTB/SS處理小鼠后，體重并未如預(yù)期的那樣顯著增加，處理組血清中除均可檢測(cè)到抗生長抑素抗體之外，還可檢測(cè)到高水平抗CTB抗體水平，與對(duì)照組比較CTB/SS組抗CTB抗體水平增加了28.69％(P＜0.05)。結(jié)果表明GM-CSF/SS可有效誘導(dǎo)生長抑素抗體的產(chǎn)生及增加免疫小鼠體重，有望進(jìn)一步應(yīng)用于大型動(dòng)

7、物研究;而盡管CTB/SS同樣可以誘導(dǎo)生長抑素抗體的產(chǎn)生，但可能是高水平的CTB抗體抑制了動(dòng)物的生長及體重的增加。
　　 3.肌抑素單鏈抗體
　　 經(jīng)過密碼子優(yōu)化、全基因合成成功構(gòu)建了全長為759 bp的抗肌抑素單鏈抗體，并成功在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)純化發(fā)現(xiàn)單鏈抗體可有效結(jié)合肌抑素(P＜0.05)，而且該單鏈抗體可顯著促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，高濃度(8μg/ml)的單鏈抗體可提高成肌細(xì)胞增殖活性達(dá)31.11％(P＜0.01)，而

8、且還可以降低肌抑素誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞增殖抑制達(dá)55.48％(P＜0.01)，顯著抑制肌抑素所誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白抑制劑p21表達(dá)（降低了22.48％，P＜0.05）;而且單鏈抗體還可抑制過氧化氫所誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞E3泛素連接酶atrogin-1(MAFbx)和muscle ring finger1(MuRF1)的表達(dá)，與高濃度過氧化氫組比較，單鏈抗體共處理組的MuRF1和MAFbx表達(dá)量分別下調(diào)了80.41％(P=0.00013)和57