柴胡全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)和遺傳圖譜的構(gòu)建及蠶豆病毒屬病毒的鑒定.pdf

1、柴胡為傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum L.)植物,具有解表合里、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣之功效,是我國(guó)重要的藥用植物。本研究構(gòu)建柴胡(B.chinense DC.)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù),并從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選了3902個(gè)單克隆進(jìn)行5’端測(cè)序,挖掘SSR位點(diǎn),并在對(duì)文庫(kù)測(cè)定序列的分析研究過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)了與蠶豆萎蔫病毒2(Broad bean willvirus2.BBWV-2)同源性很高的克隆,推測(cè)構(gòu)建柴胡文庫(kù)的試料

2、可能被BBWV-2侵染。因此,利用RT-PCR和指示植物接種方法,鑒定了侵染柴胡的病毒。最后,利用ISSR和開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記構(gòu)建柴胡分子遺傳圖譜。為進(jìn)一步開(kāi)展柴胡功能基因組學(xué)及柴胡分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)主要結(jié)果如下:
　　 (1)利用SMART技術(shù)構(gòu)建了柴胡根全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。從文庫(kù)中隨機(jī)選擇了3902個(gè)克隆進(jìn)行5’端單反應(yīng)測(cè)序,獲得了3111個(gè)高質(zhì)量cDNA序列,包括377個(gè)序列重疊群和1273個(gè)單一序列共1

3、650個(gè)獨(dú)立基因。文庫(kù)插入片段平均長(zhǎng)度約1.1 kb,全長(zhǎng)比率約51.5％。
　　 (2)利用BlastX分析結(jié)果表明949(57.5％)個(gè)獨(dú)立基因和已鑒定基因同源,680(41.2％)個(gè)獨(dú)立基因與GenBank中未知、未命名或推測(cè)的蛋白基因同源,21個(gè)獨(dú)立基因沒(méi)有找到同源基因。
　　 (3)在1650個(gè)獨(dú)立基因中82個(gè)含有SSR位點(diǎn),其中4個(gè)獨(dú)立基因有兩個(gè)SSR位點(diǎn),共挖掘了86個(gè)SSR位點(diǎn),為柴胡遺傳圖譜的構(gòu)建,遺傳

4、多樣性的分析及種質(zhì)鑒定提供有效的分子標(biāo)記。
　　 (4)在對(duì)文庫(kù)測(cè)定序列的分析研究過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)重疊群45與BBWV-2病毒的核酸序列有很高的同源性,推測(cè)構(gòu)建柴胡文庫(kù)的試料可能被BBWV-2侵染。
　　 (5)首次在柴胡上發(fā)現(xiàn)了蠶豆萎蔫病毒2的侵染,利用檢測(cè)蠶豆病毒屬不同種的特異引物對(duì)染病柴胡進(jìn)行了RT-PCR鑒定。并將染病柴胡上的病毒機(jī)械接種到莧色藜(Chenopodium Amaranticolor)指示植物上。結(jié)果證

5、實(shí)了侵染柴胡的病毒為BBWV-2。
　　 (6)ISSR和SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性:經(jīng)父母本多態(tài)性篩選,從30條ISSR和44對(duì)SSR引物中篩選出28條ISSR和14對(duì)SSR多態(tài)性引物,擴(kuò)增出168條多態(tài)性條帶,其中有36個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)偏分離,頻率為21.4％。
　　 (7)遺傳圖譜的構(gòu)建:通過(guò)對(duì)F1代進(jìn)行基因型和連鎖分析,初步構(gòu)建了包含13個(gè)連鎖群,80個(gè)(72個(gè)ISSR和8個(gè)SSR)位點(diǎn)的首張北柴胡遺傳圖譜。該圖譜覆蓋長(zhǎng)度