兔病毒性出血癥病毒病毒樣顆粒的制備及PK13細(xì)胞cDNA表達(dá)型文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、兔瘟是對(duì)養(yǎng)兔業(yè)造成最大危害的一種重要病毒性傳染病,具有高度接觸性致死性。其病原體是兔出血癥病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV),屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)。杯狀病毒科病毒具有較廣的宿主范圍,能引起多種動(dòng)物和人類疾病。杯狀病毒侵入宿主細(xì)胞是病毒進(jìn)行感染的首要環(huán)節(jié),杯狀病毒首先需要與受體結(jié)合,之后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。關(guān)于杯狀病毒的細(xì)胞受體,目

2、前只在少數(shù)幾個(gè)種屬中獲得了一定的進(jìn)展,但關(guān)于RHDV的細(xì)胞受體仍是一片空白。為了篩選和鑒定RHDV的細(xì)胞受體,我們利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了RHDV的衣殼蛋白(VP60),純化獲得了病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)以及利用SMART方法構(gòu)建了RHDV的宿主細(xì)胞-RK13細(xì)胞的cDNA真核表達(dá)文庫(kù)。
　　 1.RHDV JX/97分離株VLPs的制備
　　 以實(shí)驗(yàn)室保存的JX/97分離株全長(zhǎng)

3、cDNA分子克隆質(zhì)粒pBIRHDV為模板,設(shè)計(jì)并合成了覆蓋JX/97分離株基因組中vp60的含酶切位點(diǎn)的引物對(duì),通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得vp60基因,將基因片段雙酶切后分別克隆到桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacl上。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac后發(fā)生轉(zhuǎn)座,通過(guò)“三抗”板和藍(lán)白斑法篩選到陽(yáng)性克隆后,提取重組Bacmid DNA,轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,6天后收集上清,用上清重新感染新的Sf9細(xì)胞,依次感染細(xì)胞2次。待Sf9細(xì)胞發(fā)生明顯病變時(shí),收集上清即為

4、重組桿狀病毒,取部分用于檢測(cè)或擴(kuò)大培養(yǎng)。間接免疫熒光和Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明重組蛋白在Sf9細(xì)胞中正確表達(dá),進(jìn)一步的電鏡觀察顯示重組病毒感染的Sf9細(xì)胞內(nèi)以及純化的重組蛋白都能自我組裝形成VLPs。
　　 2.RHDV JX/97分離株宿主細(xì)胞RK13 cDNA真核表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建
　　 以兔腎細(xì)胞系RK13為材料提取細(xì)胞總RNA,然后用鏈霉親和素磁珠(SA-PMP)分離純化獲得mRNA。利用SMART技術(shù),

5、即以SMART IV Oligonucleotid作為接頭,在3ˊ末端加上一段序列,再利用CDSⅢ/3ˊPCR Primer盡量將mRNA全部反轉(zhuǎn)錄成cDNA,從而獲得了全長(zhǎng)cDNA的第1鏈,用LD-PCR方法擴(kuò)增雙鏈cDNA。經(jīng)SfiⅠ酶切后過(guò)柱分級(jí)收集ds cDNA,選取大片段ds cDNA(>500 bp),核酸沉淀后克隆到SfiⅠ酶切的真核表達(dá)載體pEXP-Lib中。最后,利用電轉(zhuǎn)儀1.8 KV200 Q25μF,電轉(zhuǎn)化至宿主菌

6、電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)獲得了cDNA文庫(kù),通過(guò)計(jì)算文庫(kù)的庫(kù)容量達(dá)到2.55×105CFU,隨機(jī)挑取16個(gè)克隆,用合成的載體上的測(cè)序引物PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)插入的cDNA片段大小在400-2250 bp之間,插入片段的平均長(zhǎng)度約1.0 Kb。以上結(jié)果表明,利用RHDV宿主細(xì)胞RK13為材料,構(gòu)建了一個(gè)較高質(zhì)量的全長(zhǎng)cDNA真核表達(dá)文庫(kù),庫(kù)容量達(dá)2.55×105CFU,可以滿足后續(xù)工作的需要。
　　 表達(dá)獲得的RHDV空衣殼蛋白及其