蠶豆病鑒定的實驗設計

1、★年級、專業(yè)、班級： 2010級臨床三、四大班★實驗課時間：2012年4月18日★實驗室：第二實驗室★組別：第四組★組員：梁婧、和珍、李艷、張玲藝、解汐卓、成春梅、 吳皎、楊紫燕、王驍、張慶昆★報告人：吳皎,患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。 體格檢查：體溫38℃，脈搏1

2、50次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。 實驗室檢查：紅細胞 1.98×1012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5µmol/L，結合膽紅素13.7µmol/L，未結合膽紅素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潛血(+)，尿膽紅素(－)

3、，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細胞。,案例,,1、根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初 步判斷患兒是何種疾??？2、請設計實驗進一步明確診斷。3、從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果。4、 要想探討該病發(fā)生的分子基礎，可以用哪些技術檢測什么目的基因？5、 患者體型瘦小與該病癥是否有關，為什么？,,初步判斷患兒是何種疾?。?紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥

4、（蠶豆?。?性別：男性年齡：3歲主要癥狀：體溫38℃、面色蒼白、血尿1天、皮 膚及鞏膜黃染、惡心、嘔吐 誘因：1天前食用新鮮蠶豆既往史：患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況,·概念：G6PD缺乏癥是一種遺傳性溶血性疾病。發(fā)病率 具有地方、民族差異性。,發(fā)病機制：,G6PD↓,→NADPH+H+↓,

5、→GSH↓,→ 紅細胞的抗 氧化能力↓,→發(fā)生溶血,紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥,正常紅細胞,溶血性貧血 紅細胞,左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒（黃疸）,左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒（黃疸）,正常紅細胞,溶血性貧血 紅細胞,左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒（黃疸）,正常紅細胞,溶血性貧血 紅細胞,左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒（黃疸）,·分類： 伯氨喹啉型藥物性溶血性貧血

6、 新生兒黃疸 蠶豆病 感染性溶血 先天性非球形細胞溶血性貧血（CNSHA）,紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥,蠶豆病 是一種6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏所導致的疾病，表現(xiàn)為在遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷的情況下，食用新鮮蠶豆后突然發(fā)生的急性血管內(nèi)溶血。,,紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥,主要臨床表

7、現(xiàn)：早期有惡寒、微熱、頭昏、倦怠無力、食欲缺乏、腹痛，繼之出現(xiàn)黃疸、貧血、血紅蛋白尿，尿呈醬油色，此后體溫升高，倦怠乏力加重，可持續(xù)3日左右。與溶血性貧血出現(xiàn)的同時，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和腹痛加劇，肝臟腫大，肝功能異常，約50%患者脾腫大。嚴重病例可見昏迷、驚厥和急性腎衰竭，若急救不及時常于1～2日內(nèi)死亡。,,,,遺傳方式：G6PD缺乏癥是一種X連鎖不完全顯性遺傳,母：XX 父：XY,,子代： XX XX XY

8、 XY,兒子一定患病，女兒則50%,母：XX 父：XY,子代： XX XX XY XY,,兒子一定正常，女兒則50%,母：XX 父：XY,,子代： XX XX XY XY,女兒50%機會患病，兒子50%機會攜帶該基因,X---致病基因,患該病的男女比例約為=7:1,,從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果,主要臨床表現(xiàn)：1. 血尿、排醬油色尿、面色蒼白

9、 2. 皮膚及鞏膜黃染 3. 體溫升高 4. 呼吸急促,1. 血尿、排醬油色尿、面色蒼白,,G6PD↓,GSSG(氧化型谷胱甘肽),,,NADPH+H+,NADP+,,A,AH2,2GSH(還原型谷胱甘肽),GSH的主要作用：① 保護紅細胞內(nèi)的含硫氫基（-SH）血紅蛋白

10、 、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化 ② 與谷胱甘肽過氧化酶共同使H2O2還原成H2O,→NADPH+H+↓,→紅細胞的抗氧化能力↓,→GSH↓,→紅細胞 膜破裂,→溶血性貧血（面色蒼白）,→游離Hb>腎 吸收閾值,→血紅蛋白尿/ 含鐵血黃素尿,,,2. 皮膚及鞏膜黃染,機理：溶血性黃疸,,,3

11、. 體溫升高,機理： 紅細胞破裂,↓ 血紅蛋白暴露,↓ 免疫系統(tǒng)攻擊（單核-吞噬細胞系統(tǒng)）,↓ 體溫升高,,4. 呼吸急促,溶血性貧血 ↓具有載O2能力的Hb含量下降↓機體缺O(jiān)2↓呼吸急促,紅細胞 1.98×1012/L ↓↓（6.0-7.0）×1012 血紅蛋白53g/L

12、 ↓↓（170-200)g/L 血清總膽紅素85.5µmol/L ↑↑（3.4-17.1）µmol/L 結合膽紅素13.7µmol/L — 未結合膽紅素71.8µmol/L ↑↑ 尿蛋白（++

13、） 、潛血(+) 尿膽紅素(－)、尿膽素原(+),從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果,實驗室檢查結果 正常值,,,,,2、設計實驗進一步明確診斷。,貧血、黃疸,有和無遺傳史,無或有誘因（食用蠶豆、服用藥物、感染）,體征：脾腫大、黃疸,血常規(guī)檢查,血清學檢查,檢查HA的病因,G6PD篩選試驗,G6PD確診試驗,Hb↓、網(wǎng)織紅細胞↑,間接膽紅素↑尿膽原↑游離Hb↑結合珠蛋白↓,懷

14、疑其他HA,相應病因檢測結果正常,G6PD熒光斑點試驗,紅細胞G6PD活性測定,,,G6PD基因分析,其他篩選試驗,高鐵血紅蛋白還原試驗,,初診或確診G6PD缺陷癥,確診溶貧（血管內(nèi)溶血）,確診G6PD,,,,,,,做1項或2項,做1項,,高鐵血紅蛋白還原試驗 G6PD熒光斑點試驗 紅細胞G6PD活性測定,,,,篩選試驗,→確診試驗,,一、高鐵血紅蛋白還原試驗,實驗原理：在全血中加入亞硝酸

15、鈉，使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白（MHb）,高鐵血紅蛋白在高鐵血紅蛋白還原酶的作用下又被還原為亞鐵血紅蛋白。在這過程中，高鐵血紅蛋白還原酶不僅需要亞甲藍作為遞氫體，還需要由G6PD參與磷酸戊糖途徑形成NADPH作為輔酶才完成上述反應。所以，G6PD缺陷癥的患者其MHb還原率下降（分光光度技術）。,亞鐵血紅蛋白 高鐵血紅蛋白,亞硝酸鈉,高鐵血紅蛋

16、白還原酶 NADPH(輔酶) 亞甲藍(遞氫體),,,實驗反應方向,實驗原理,主要試劑：0.18mol/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液①、 0.4mmol/L亞甲藍溶液 ②、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液③、混合液 （等量①+②+③）、生理鹽水、抗凝劑,儀器：紫外分光光度計水浴箱、離心機、試管3支,高鐵血紅單白還原實驗,實驗流程,取靜脈血1. 8mL 于抗凝管，混勻抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝劑+葡萄糖

17、20 mg),,離心沉淀 1000 r/ min 15 min,,調(diào)整 血細胞∶血漿=1∶1 ，混勻 → 調(diào)整后全血（備用）,,1ml 0. 18 mol/ L 亞硝酸鈉1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混勻 → 混合試劑（備用） 1ml 0.14 mmol/ L 亞甲基藍液,高鐵血紅單白還原實驗,,實驗流程,取試管3 支,標上A、B、S ,按下表加入試劑,高鐵血紅蛋白還原試驗操作步驟,混

18、合試劑/ mL 0. 01 / /生理鹽水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亞硝酸鈉- / /

19、 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 經(jīng)調(diào)整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1來回搖動15～20 次,置37 ℃水浴箱靜置3 h蒸餾水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml,,試劑

20、 A B S,,,,高鐵血紅單白還原實驗,B管為空白管, 在波長635 nm處，測定“A”管及“S”管吸光度,,實驗流程,計算高鐵血紅蛋白還原率公式：MHb % = (1 - A/ S) ×100 %,高鐵血紅單白還原實驗,實驗過程注意事項,實驗一（高鐵血紅蛋白還原試驗）：,1、血細胞

21、比容比值過低，高鐵血紅蛋白還原率降低。 應將血細胞比容調(diào)整到0.35-0.402、細菌污染可產(chǎn)生亞硝酸鹽而造成假陽性，試管等 應無菌3、不穩(wěn)定Hb、高脂血癥等均可出現(xiàn)假陽性結果， 故應2h內(nèi)送檢4、標本不應有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在標本內(nèi)應適當加入葡萄糖，以避免較全血缺乏,,二、G6PD熒光斑點試驗,實驗原理：葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同

22、時使NADP轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH,后者在340nm波長紫外線照射下產(chǎn)生熒光（反應原理如下圖）。所以將含有G6P和NADP等的混合試劑與血混勻后在0分鐘、5分鐘、10分鐘分別取1滴血到濾紙上，通過觀察濾紙上有熒光出現(xiàn)時間可判斷G6PD活性,,NADP NADPH,,G6P 6PGA,G6PD,,

23、實驗原理,試劑：反應液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸鹽緩沖液3份和蒸餾水3份混勻,儀器：長波紫外燈、濾紙、水浴箱,G6PD熒光斑點試驗,實驗流程,,G6PD熒光斑點試驗,取試管，加10μl全血+100μl反應液，混勻，取一滴于濾紙上（第一斑點 ）→作為對照,將上液置于37℃水浴10min ，再取一小滴滴于濾紙上（第二斑點）→實驗組,晾干后，于長波紫外燈下（365nm）觀察結果，計時,,,,根據(jù)結果作出相應診斷,實

24、驗二（G6PD熒光斑點試驗 ）：1、檢測的第一點作為實驗對照應無熒光或弱熒光出現(xiàn)2、每次試驗應用正常標本（已知G-6-PD正常）作陰 性對照。如可能選用已知G-6-PD缺乏者的標本作 陽性對照3、如貧血嚴重取血量應相應加大，或用紅細胞混懸液 進行檢驗4、為提高敏感性可在反應液中加入1份8.0mmol/L GSSG,實驗過程注意事項,,三、紅細胞G6PD活性測定,實驗原理：

25、基本原理同G6PD熒光斑點實驗。不同的是利用紫外光分光光度法定量測定酶活性，即每隔一分鐘在340nm波長測定孵育液中NADPH吸光度（測6次），求每分鐘吸光度增加的平均值，根據(jù)單位時間內(nèi)NADPH生成由于所用試劑及體系的不同。方法：①WHO推薦的Zinkham;②NBT定量法等,實驗原理,試劑：生理鹽水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris緩沖液（pH7.5） 、0.63mol/L氯化鎂溶液 、33m

26、mol/L G-6-P液,儀器：紫外分光光度計水浴箱、離心機、試管,實驗流程,取抗凝血2ml，生理鹽水洗滌紅細胞3次（1500r/min離心 10min）,除去上清液和乳白層（白細胞和血小板）加等體積生理鹽水→紅細胞懸液,紅細胞懸液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min → 溶血液并測定其Hb濃度,進行比色 （見下表）,,,,紅細胞G6PD活性測定,G-6-PD活性測定的操作表（Zinkham法 ),試管

27、 對照管 測定管,NADP液（ml） 0.1 0.1Tris液（ml） 0.1 0.1氯化鎂液（ml） 0.1 0.1蒸餾水（ml） 0.68

28、 0.58G6P液（ml） — 0.1 37℃預熱溶血液（μl） 20 20,,,,,紅細胞G6PD活性測定,,,立即340nm處測吸光度，以對照管調(diào)零，37℃恒溫，每分鐘觀察1次，記錄吸光度的變化,實驗流程,計算公式：G-6-PD

29、活性（U/gHb） =△A/min×1000/6.22×1020/20× Hb(gL-1),△A/min:每min吸光度的平均變化值1000/6.22:為微摩爾消光系數(shù)1020/20:總容量與溶血液的量之比；,實驗流程,紅細胞G6PD活性測定,實驗三（紅細胞G6PD活性測定）： 1、急性溶血期后2~3個月再查或復查 G6PD活性 2、最好同時作陰性對

30、照和陽性對照（影 響因素多） 3、離心沉底后應取底層紅細胞測定 G6PD活性,實驗過程注意事項,結果分析方法,一、高鐵血紅蛋白還原試驗： 正常值：MHb還原率>=75%，臍血>=77% 臨床診斷：純合子和半合子（XY）患者： MHb還原率< 30% 臍血<

31、 40% 雜合子患者： MHb還原率< 31%~74% 臍血< 41%~76%,二、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點試驗 正常人： 0min斑點無熒光，5-10min出現(xiàn)， 10min熒光最強 臨床診斷： 輕度缺陷者：

32、0-10min熒光很弱或不出現(xiàn) 中度缺陷者：10-30min出現(xiàn)熒光 嚴重缺陷者：30min內(nèi)不出現(xiàn)熒光,結果分析方法,三、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測定G6PD缺陷者：G6PD活性較正常平均值低40%以 上即可作出診斷,方法 正常值范圍,,WHO推薦的Zinkh

33、am (12.01±2.09)IU/gHb(37℃)ICSH推薦的Glock與McLoan法 （8.34±1.59）IU/gHb(37℃)NBT定量法 （13.1~30.0）NBT單位Chapman和Dern法

34、 （2.8~7.31）IU/gHb(25℃),,,,結果分析方法,G6PD缺乏癥的診斷要點,,臨床符合上述任何一型，加上以下各項中任何一項均可診斷①1項篩選試驗活性嚴重缺乏值②1項篩選試驗活性屬中間缺乏值，伴有明確的家族史③2項篩選試驗活性均屬中間缺乏值④1項G6PD活性定量測定其活性較平均值降低40%以上,,,綜合診斷 診斷要點,,,可以用哪些技術檢測什么目的基因？ ——G6PD基

35、因分析,,,·探針技術 放射性核素 生物素（DIG探針） 熒光染料 ·印跡技術,,DNA印跡蛋白質(zhì)的印跡分析,實驗原理：原位雜交（in situhybridization histochemistry ISHH）屬于分子雜交的一種，是一種應用標記探針與組織細胞中的待測核酸雜交，再應用標記物相關的檢測系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術。,原位雜交技術,原位雜交

36、技術（DIG探針）,主要試劑：二甲苯、各級濃度酒精、蒸餾水、0.01mol/LPBS 、3%雙氧水-甲醇溶液 、打孔液 、過氧化氫封閉液 、消化工作液（胃蛋白酶） 、預雜交工作液 、雜交工作液 （探針）、抗地高辛生物素標記的抗體工作液 、高敏過氧化物酶鏈親和素復合物工作液 、DAB 、各種濃度的緩沖液（SSC、PBS、TBS）,主要儀器：恒溫箱、濕盒、搖床、染色缸、移液槍,原位雜交技術（DIG探針）,,二甲苯脫蠟→各級酒精脫水→3%H2