木材藍(lán)變生物控制菌康氏木霉幾丁質(zhì)酶的純化與克隆.pdf

1、本研究是以康氏木霉為供試菌株(6111-ET)進(jìn)行幾丁質(zhì)酶純化、特性的研究，并對(duì)康氏木霉幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行克隆、測序和初步的生物信息學(xué)分析，為探明其抑制木材藍(lán)變菌的作用機(jī)制，工業(yè)化生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶制成生物制劑，應(yīng)用于木材藍(lán)變色生物控制提供科學(xué)依據(jù)。 康氏木霉在液態(tài)PDA培養(yǎng)基中置于恒溫?fù)u床(200r/min,28℃)上培養(yǎng)10d，誘導(dǎo)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。培養(yǎng)濾液通過硫酸銨分級(jí)沉淀，Q-HP強(qiáng)陰離子交換柱層析、Phenyl-Sepharose

2、疏水層析、CM-Sepharose弱陽離子交換柱層析、Phenyl-Sepharose疏水柱層析，從康氏木霉培養(yǎng)的上清液中分離純化了幾丁質(zhì)酶。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳純度分析表明，純化后的幾丁質(zhì)酶基本達(dá)到了均一的程度，該酶的分子量約為36kDa。 本研究對(duì)康氏木霉的幾丁質(zhì)酶的基本性質(zhì)進(jìn)行了測定。結(jié)果表明：該酶最適反應(yīng)溫度為40℃，水解幾丁質(zhì)的最適pH范圍為3～6之間。在熱穩(wěn)定性方面，分別在30℃和60~C下保溫80min后仍然

3、可以保持原有的酶活力，溫度過60℃以后，相對(duì)酶活開始下降；該酶對(duì)高溫有一定的抵抗力，隨著溫度的升高，酶活力仍保持在60％左右。不同的金屬陽離子對(duì)該酶都有不同的影響，Ca2+、Fe2+對(duì)酶活力有比較明顯的激活作用，其中Fe2+的作用最強(qiáng)；而K+、Na+、Cu2+則有明顯的抑制作用。 本研究利用改進(jìn)CTAB法提取康氏木霉總DNA，根據(jù)已發(fā)表康氏木霉幾丁質(zhì)酶DNA同源序列設(shè)計(jì)出引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到幾丁質(zhì)酶基因片段