擬康氏木霉胞外多糖誘導(dǎo)癌細胞凋亡的研究.pdf

1、惡性腫瘤是導(dǎo)致人類死亡的一個主要原因。中國癌癥死亡率已經(jīng)超過了腦血管疾病，位居死亡原因之首。白血病，又名血癌，是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病?；熀退幬镏委熓悄壳爸委煱籽〉闹饕侄?，而市場上能有效的治療白血病的化學(xué)藥物都有毒副作用。因此研究一種具有對機體毒副作用小，達到抑制和殺死惡性腫瘤細胞的目的藥物成為抗腫瘤藥研究的新的焦點。
　　 近幾十年，大量具有活性的多糖從食用真菌，植物，藻類，酵母等中分離出來。研究表明活性多糖

2、除了具有抗衰老、抗病毒、降血糖、刺激造血等作用外，還具有抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)活性，且對機體的毒副作用小。最近的研究又發(fā)現(xiàn)活性多糖能直接誘導(dǎo)癌細胞凋亡。通過誘導(dǎo)癌細胞凋亡治療癌癥已被證實為一種高效和重要的策略。因此，尋找一種能夠誘導(dǎo)癌細胞凋亡的活性多糖，作為腫瘤治療藥物或者輔助治療藥物將非常有意義。
　　 本實驗室前期工作已經(jīng)完成擬康氏木霉胞外多糖EPS-1和EPS-2的分離純化及其單糖組成等測定工作。EPS-1分子量為31930Da

3、，單糖組成及摩爾比為鼠李糖∶木糖∶果糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=16.2∶14.4∶1∶25.8∶23.6∶48.1;EPS-2的相對分子量為18325Da，單糖組成為鼠李糖、葡萄糖和少量的半乳糖，摩爾比為Rha∶Glc∶Gal=5.6∶2.7∶1.0，初步分析表明這兩種胞外多糖均為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖。本課題組還研究發(fā)現(xiàn)EPS-1和EPS-2具有很強的免疫活性，而本文對EPS-1、EPS-2體外抑制腫瘤細胞的增殖活性和EPS-1誘導(dǎo)K56

4、2細胞凋亡的機制進行了研究。
　　 1.采用SRB法對擬康氏木霉胞外多糖體外EPS-1和EPS-2體外對腫瘤細胞增殖抑制作用進行評價。當(dāng)用不同濃度的EPS-1和EPS-2處理人白血病K562、HL-60和人胃癌SGC-790124h、48h和72h后發(fā)現(xiàn)，EPS-1和EPS-2都能夠抑制它們的增殖，并且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，其中用濃度為1mg/mL的EPS-1處理人白血病K562細胞72h后，抑制率達到最大，為41％左右。

5、>　　 2.采用Hoechst33258染色方法觀察擬康氏木霉胞外多糖處理腫瘤細胞后，細胞形態(tài)學(xué)的變化。分別加入含有不同濃度的胞外多糖培養(yǎng)48h，染色后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。對照組細胞形態(tài)一致，染色均勻，均呈現(xiàn)出微弱的藍色熒光，而經(jīng)過胞外多糖作用48h后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，逐漸出現(xiàn)呈濃度致密的顆粒狀強藍熒光的細胞核，并且隨著EPS-1濃度的增加，數(shù)量逐漸增多。結(jié)果提示胞外多糖是通過誘導(dǎo)癌細胞凋亡來抑制其增殖的。我們進一步使用Ann

6、exinV-FITC/PI染色方法進行確認。結(jié)果表明隨著擬康氏木霉胞外多糖濃度的升高，發(fā)生早期凋亡的K562細胞越來越多，達到了20.5％，說明了磷脂酰絲氨酸由內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)到了外膜，支持了上述實驗結(jié)果。
　　 3.EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細胞凋亡的機制研究。為了探究機理，我們分別采用了JC-1熒光探針來檢測線粒體膜電位的變化，DCFH-DA熒光探針來檢測胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，F(xiàn)luo-3/AM熒光探針來檢測細胞內(nèi)的鈣離子濃度。結(jié)果發(fā)

7、現(xiàn)EPS-1處理K562細胞后，線粒體膜電位下降，細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)量增加，細胞內(nèi)鈣離子的濃度升高。這些結(jié)果表明線粒體途徑參與了EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細胞的凋亡。
　　 4.為了進一步探究EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細胞凋亡的機制，我們采用RT-PCR方法檢測EPS-1處理白血病K562細胞后p53、Bcl-2、Bax、FasL和Fas的mRNA的表達量的變化。通過結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)，Bcl-2的mRNA的表達量隨著濃度的升高

8、不斷降低，而p53和Bax的mRNA的表達量剛好相反。Bcl-2與Bax的mRNA的表達量的比值不斷降低。FasL和Fas的mRNA表達量不斷增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果再次證明了線粒體途徑參與了EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細胞凋亡，并且發(fā)現(xiàn)細胞膜受體途徑也有參與。
　　 研究結(jié)果表明EPS-1能夠通過Fas介導(dǎo)的細胞膜受體途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)K562細胞發(fā)生凋亡。通過對EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細胞凋亡機制的分析，為白血病的治