擬康氏木霉胞外多糖誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、惡性腫瘤是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的一個(gè)主要原因。中國(guó)癌癥死亡率已經(jīng)超過(guò)了腦血管疾病，位居死亡原因之首。白血病，又名血癌，是一類(lèi)造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病?；熀退幬镏委熓悄壳爸委煱籽〉闹饕侄?，而市場(chǎng)上能有效的治療白血病的化學(xué)藥物都有毒副作用。因此研究一種具有對(duì)機(jī)體毒副作用小，達(dá)到抑制和殺死惡性腫瘤細(xì)胞的目的藥物成為抗腫瘤藥研究的新的焦點(diǎn)。
　　 近幾十年，大量具有活性的多糖從食用真菌，植物，藻類(lèi)，酵母等中分離出來(lái)。研究表明活性多糖

2、除了具有抗衰老、抗病毒、降血糖、刺激造血等作用外，還具有抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)活性，且對(duì)機(jī)體的毒副作用小。最近的研究又發(fā)現(xiàn)活性多糖能直接誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡治療癌癥已被證實(shí)為一種高效和重要的策略。因此，尋找一種能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的活性多糖，作為腫瘤治療藥物或者輔助治療藥物將非常有意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)完成擬康氏木霉胞外多糖EPS-1和EPS-2的分離純化及其單糖組成等測(cè)定工作。EPS-1分子量為31930Da

3、，單糖組成及摩爾比為鼠李糖∶木糖∶果糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=16.2∶14.4∶1∶25.8∶23.6∶48.1;EPS-2的相對(duì)分子量為18325Da，單糖組成為鼠李糖、葡萄糖和少量的半乳糖，摩爾比為Rha∶Glc∶Gal=5.6∶2.7∶1.0，初步分析表明這兩種胞外多糖均為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖。本課題組還研究發(fā)現(xiàn)EPS-1和EPS-2具有很強(qiáng)的免疫活性，而本文對(duì)EPS-1、EPS-2體外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性和EPS-1誘導(dǎo)K56

4、2細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　 1.采用SRB法對(duì)擬康氏木霉胞外多糖體外EPS-1和EPS-2體外對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)用不同濃度的EPS-1和EPS-2處理人白血病K562、HL-60和人胃癌SGC-790124h、48h和72h后發(fā)現(xiàn)，EPS-1和EPS-2都能夠抑制它們的增殖，并且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性，其中用濃度為1mg/mL的EPS-1處理人白血病K562細(xì)胞72h后，抑制率達(dá)到最大，為41％左右。

5、>　　 2.采用Hoechst33258染色方法觀察擬康氏木霉胞外多糖處理腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。分別加入含有不同濃度的胞外多糖培養(yǎng)48h，染色后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)一致，染色均勻，均呈現(xiàn)出微弱的藍(lán)色熒光，而經(jīng)過(guò)胞外多糖作用48h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，逐漸出現(xiàn)呈濃度致密的顆粒狀強(qiáng)藍(lán)熒光的細(xì)胞核，并且隨著EPS-1濃度的增加，數(shù)量逐漸增多。結(jié)果提示胞外多糖是通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡來(lái)抑制其增殖的。我們進(jìn)一步使用Ann

6、exinV-FITC/PI染色方法進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果表明隨著擬康氏木霉胞外多糖濃度的升高，發(fā)生早期凋亡的K562細(xì)胞越來(lái)越多，達(dá)到了20.5％，說(shuō)明了磷脂酰絲氨酸由內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)到了外膜，支持了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 3.EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究。為了探究機(jī)理，我們分別采用了JC-1熒光探針來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化，DCFH-DA熒光探針來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，F(xiàn)luo-3/AM熒光探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度。結(jié)果發(fā)

7、現(xiàn)EPS-1處理K562細(xì)胞后，線粒體膜電位下降，細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)量增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度升高。這些結(jié)果表明線粒體途徑參與了EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞的凋亡。
　　 4.為了進(jìn)一步探究EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們采用RT-PCR方法檢測(cè)EPS-1處理白血病K562細(xì)胞后p53、Bcl-2、Bax、FasL和Fas的mRNA的表達(dá)量的變化。通過(guò)結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)，Bcl-2的mRNA的表達(dá)量隨著濃度的升高

8、不斷降低，而p53和Bax的mRNA的表達(dá)量剛好相反。Bcl-2與Bax的mRNA的表達(dá)量的比值不斷降低。FasL和Fas的mRNA表達(dá)量不斷增加，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。結(jié)果再次證明了線粒體途徑參與了EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜受體途徑也有參與。
　　 研究結(jié)果表明EPS-1能夠通過(guò)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞膜受體途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過(guò)對(duì)EPS-1誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡機(jī)制的分析，為白血病的治