棘孢木霉菌幾丁質(zhì)酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、Cloning，ExpressionandEnzymeCharacterizationAnalysisofChitinaseGenefromTrichodermaasperellumThesissubmittedtoO物daoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequire：mentfortheDegreeofMasterofScienceCongDaPeng(CollegeofLifeSc

2、ience)Supervisor：XianHongquanQingdaoChinaJune，2012青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要摘要木霉菌作為一種生防菌，在生物防治中占有極其重要的地位，在其重寄生過程中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶能夠降解多種病原菌細(xì)胞壁。幾丁質(zhì)酶普遍存在于各種動物、植物和微生物中，在醫(yī)藥、食品、環(huán)保、生防等許多領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。國內(nèi)外已經(jīng)篩選出多種幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生茵，并將其進(jìn)行分離純化。但只有部分在實際中得到應(yīng)用，主要原因是菌株

3、的產(chǎn)酶能力較低。因此克隆幾丁質(zhì)酶基因、實現(xiàn)其高效表達(dá)是解決問題的一條重要途徑。本文根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因序列保守區(qū)設(shè)計簡并引物、再根據(jù)克隆到的幾丁質(zhì)酶基因片段序列設(shè)計特異性引物，運(yùn)用RTPCR、RACEPCR、TAILPCR技術(shù)，從木霉菌Td3104中克隆出完整的幾丁質(zhì)酶基因tachi2。全長DNA序列為1447br，閱讀框架(ORF)位于31～1364位核苷酸之間，包含2段內(nèi)含子序列，編碼397個氨基酸。該基因DNA序列已提交GenBank

4、，登錄號為JF309106。利用DNAMAN軟件對木霉菌Td3104幾丁質(zhì)酶的分子量、等電點、疏水性和親水性等性質(zhì)進(jìn)行了分析，同時還預(yù)測了其二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白的分子量為44482kDa，等電點為567。分別將幾丁質(zhì)酶基因tachil和tachi2與原核表達(dá)載體pEHisTEV融合，構(gòu)建了表達(dá)載體pEHisTEV／tachil和pEHisTEV／tachi2，將重組表達(dá)質(zhì)粒pEHisTEV／tachil和pEHisTEV／tachi

5、2分別轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過PCR檢測及篩選，轉(zhuǎn)化子進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得了以包涵體形式高效表達(dá)的Tachil和Tachi2。包涵體經(jīng)洗滌、溶解、復(fù)性和純化后獲得了高純度的Tachil和Tachi2。復(fù)性后的Tachil和Tachi2具有較高的幾丁質(zhì)酶活性，收集幾丁質(zhì)酶蛋白，進(jìn)行SDSPAGE電泳，得出重組蛋白Tachil和Tachi2的分子量都約為44kDa。幾丁質(zhì)酶Tachil最適反應(yīng)溫度是35℃，最適反應(yīng)pH值為60。T

6、achil凡丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性測定結(jié)果表明，酶液在30℃以下溫度處理1h，酶性質(zhì)穩(wěn)定；在pH59條件下處理1h，活性變化不明顯。K金屬離子對酶活力有明顯的激活作用，而Zn2、Cu2、M92等對該酶有明顯的抑制作用。幾丁質(zhì)酶Tachi2的最適溫度為40。C，最適pH值為70，在pH68時酶活性質(zhì)較穩(wěn)定；Mn2、Fe2對表達(dá)幾丁質(zhì)酶有激活作用，其中Mn2的激活作用最明顯，F(xiàn)e2次之；Cu2、Zn2等對表達(dá)幾丁質(zhì)酶有顯著的抑制作用；而K、Nr對酶