康氏木霉as3.2774纖維素酶系的誘導(dǎo)、阻遏、純化及鑒定研究

1、廣西大學(xué)博士學(xué)位論文康氏木霉AS3.2774纖維素酶系的誘導(dǎo)、阻遏、純化及鑒定研究姓名：林元山申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：梁智群20101205和菌體形態(tài)分化差異。其中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅳ中，菌絲體比重較大且飽滿壯實，孢子比重較小，生物量較少，纖維素酶產(chǎn)物比生產(chǎn)率較快；在一般性誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ中，菌絲體比重較小且易衰竭，孢子比重較大，生物量較多，纖維素酶產(chǎn)物比生產(chǎn)率較慢；康氏木霉在阻遏培養(yǎng)基V 發(fā)酵過程中，出現(xiàn)兩次產(chǎn)物比生產(chǎn)率的增

2、速過程，但幅度比誘導(dǎo)培養(yǎng)基低，體現(xiàn)阻遏解除的機制。6 、康氏木霉A S 3 ．2 7 7 4 的纖維素酶的代謝調(diào)控實質(zhì)基因水平的誘導(dǎo)與阻遏，是纖維素酶蛋白在合成“量’’上的調(diào)節(jié)，二者胞外蛋白差異十分顯著，其中被誘導(dǎo)的纖維素酶胞外蛋白是被阻遏的纖維素酶胞外蛋白的3 8 倍以上，體現(xiàn)康氏木霉優(yōu)先利用現(xiàn)有資源的進化機制。7 、論文研究了“聚丙烯酰胺凝膠活性電泳電洗脫二步循環(huán)法“ 分離康氏木霉纖維素酶系的條件，獲得有別于S c h 丟i g g

3、 e r 和O f f o r d 的電泳方案的最優(yōu)條件為：分離膠梯度4 ％- 8 ％；膠長1 8 0 m m ；濃縮膠電壓，8 0 - 1 0 0 V ，電流2 ∞0 m A ；分離膠電壓1 8 0 - 2 0 0V ， 電流< 3 0 m A = 電泳緩沖液離子濃度，1 2 ．5 m m o l ／L T r i s —g l y c i n9 6m m o l ／L ，電泳時間為1 0 —1 2h ，4 。C 環(huán)境條件操作。

4、8 、通過對纖維素酶系的分離純化研究，提出了“聚丙烯酰胺凝膠活性電泳電洗脫二步循環(huán)法”分離純化纖維素酶的新方案，包括：( 1 ) 第一次電泳，即4 ％- 8 ％梯度膠電泳分離；( 2 ) 分區(qū)染色；( 3 ) 膠內(nèi)蛋白定位；( 4 ) 切膠分類蛋白；( 5 ) 電洗脫回收蛋白；( 6 ) 透析脫鹽、凍干；( 7 ) 第二次電泳，即均一膠活性電泳，均一膠濃度由目的蛋白在第一次電泳膠的遷移率決定，分離程序進行至第二次透析脫鹽、凍干時結(jié)束。經(jīng)

5、分離純化獲得9 個單一組分，各組分的純化效果基本一致。其中，活性蛋白P s ( 1 3 _ 葡萄糖苷酶)在第一次活性電泳分離時，純化倍數(shù)為1 7 倍，回收率為1 0 ．6 ％；在第二次活性電泳分離時，純化倍數(shù)為2 4 倍，回收率為5 ．5 ％，比活力達9 9 4 ．6I U ／( m gp r o t e i n ) ，在整個純化完成后，最后獲得8I J g 電泳純的p 葡萄糖苷酶。9 、康氏木霉纖維素酶系組分經(jīng)生物學(xué)功能測定，組分P

6、1 無p 葡萄糖苷酶活性、外切葡聚糖酶活性、內(nèi)切葡聚糖酶活性。與纖維素酶系其它組分同時被誘導(dǎo)與阻遏調(diào)控，屬于纖維素酶系，功能未知；P 3 為1 3 葡萄糖酶；P 4 、P l o 為外切葡聚糖酶；P s 、P s 、P 7 為內(nèi)切葡聚糖酶；P 2 、P s 纖維素酶活性較弱，屬于纖維素酶系；P 9 基本無纖維素酶活性，不能與纖維素酶系其它組分同時被誘導(dǎo)、被阻遏調(diào)控，不屬于康氏木霉纖維素酶系。經(jīng)胰蛋白酶酶切、基質(zhì)輔助激光解吸，電離飛行時間