萊氏野村菌Nomuraea rileyi幾丁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)與分析.pdf

1、萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一種重要昆蟲病原真菌，可以感染許多重要的害蟲如棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)，斜紋夜蛾(Spodoptera litura)，粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等，并在田間引發(fā)多種害蟲病害流行病，在生物防治及害蟲綜合治理(IPM)中有很大的應(yīng)用潛力。二十世紀(jì)七十年代到現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)Nomuraea rileyi的研究集中在三個(gè)方面：生物學(xué)、生物防治及遺傳多樣性分析。

2、但目前為止國(guó)內(nèi)尚未涉及侵染宿主分子機(jī)制的研究。 昆蟲病原真菌在穿透寄主體壁的過程中會(huì)產(chǎn)生多種水解酶例如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶。而昆蟲體表幾丁質(zhì)約占30％，構(gòu)成了昆蟲病原真菌入侵主要障礙。因此幾丁質(zhì)酶在侵染階段起著至關(guān)重要的作用。Nomuraea rileyi Cq菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離，先后對(duì)其生物學(xué)、生態(tài)學(xué)及最適產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件做了研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Nomuraea rileyi Cq菌株幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了克隆，與其它昆蟲病原真

3、菌幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了比較分析，并將該基因轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，進(jìn)行了表達(dá)和特性分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．實(shí)驗(yàn)采用CTAB法提取Nomuraea rileyi菌絲基因組，利用Primer5.0設(shè)計(jì)不同階段引物進(jìn)行多次PCR，得到了長(zhǎng)度為2756bp的含有幾丁質(zhì)酶基因的序列(GenBbank登錄號(hào)為EU795711)，幾丁質(zhì)酶基因開放閱讀框(ORF)1511bp，其中包含3個(gè)內(nèi)含子，編碼424個(gè)氨基酸。Nomuraea rile

4、yi Cq菌株與國(guó)外Nomuraea rileyi MJ菌株幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸(AAP04616)序列相似性達(dá)99％，但在4個(gè)不同的位點(diǎn)存在四個(gè)氨基酸的差異，同時(shí)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)、分子量、等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)也存在差異；Nomuraea rileyi Cq菌株與其它病原真菌 Metarhizium flavoviride(CAB44709)、Hypocrea lixii(BAB40589)、Lecanicilliumlecanii

5、(ABD77096)、Isaria farinose(ABD64606)、Stachybotrys elegans(AAM70478)、Beauveriabassiana(AAN41260)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的相似性分別為79％、74％、74％、74％、69％、64％。 2．將構(gòu)建的pPIC9K—chit1表達(dá)載體線性化后，電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母中，采用濃度為1.5mg/mL的G418平板篩選，然后對(duì)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)一步采用PCR驗(yàn)證。對(duì)

6、驗(yàn)證正確的菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。收集24h、48h、72h誘導(dǎo)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵液，分別做透明圈驗(yàn)證幾丁質(zhì)酶存在的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果48h和72h均出現(xiàn)透明圈，而72h的透明圈最明顯；測(cè)其0h、24h、48h、72h發(fā)酵液中酶的活性，結(jié)果72h酶活性出現(xiàn)最高值：最后采用TCA法沉淀48h和72h發(fā)酵液中蛋白質(zhì)，將處理的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS—PAGE電泳，由于酵母自身幾乎沒有分泌外源蛋白，所以經(jīng)SDS—PAGE電泳顯示的蛋白條帶估算分子量為41kDa，且與