水稻脆鞘基因BSH1的圖位克隆與功能分析.pdf

1、在作物育種和生產(chǎn)實(shí)踐中，植物機(jī)械強(qiáng)度是非常重要的農(nóng)藝性狀之一。細(xì)胞壁構(gòu)成了植物體的骨架結(jié)構(gòu)，是機(jī)械強(qiáng)度的決定因素。高等植物發(fā)育出兩種不同類型的細(xì)胞壁：初生細(xì)胞壁和次生細(xì)胞壁。次生細(xì)胞壁位于初生細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)，是植物停止生長(zhǎng)之后開始形成的，主要存在于厚壁組織和木質(zhì)部。深入研究細(xì)胞壁合成和裝配相關(guān)的基因可以幫助我們了解植物機(jī)械強(qiáng)度形成的分子機(jī)制。本研究鑒定了一個(gè)水稻矮化脆鞘的突變體bshl，通過圖位克隆定位了BSH1，并利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)初步研

2、究了BSH1的生物學(xué)功能。主要結(jié)果如下：
　　1.水稻脆鞘突變體bshl的表型分析
　　突變體bshl在成熟期的株高、千粒重和單株產(chǎn)量都顯著下降。bshl最顯著的變異是6周幼苗葉鞘的機(jī)械強(qiáng)度比野生型低，葉鞘變脆。透射電鏡觀察葉鞘厚壁細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)bshl的細(xì)胞壁厚度降低。進(jìn)一步分析野生型和突變體的細(xì)胞壁成分，結(jié)果顯示主要的細(xì)胞壁成分含量都不同程度地下降。
　　2. BSH1編碼細(xì)胞色素P450 CYP96B4
　　利

3、用圖位克隆的方法，將突變基因精細(xì)定位在28 kb區(qū)間內(nèi)，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)在第二個(gè)ORF，即CYP96B4的啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)未知長(zhǎng)度的片段插入，并且突變體CYP96B4的表達(dá)量下降，因此我們將CYP96B4作為BSH1的候選基因?；パa(bǔ)試驗(yàn)表明CYP96B4表達(dá)量升高的轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型類似，干擾植株中CYP96B4表達(dá)量下降的植株表型與突變體類似。因此，我們可以確定CYP96B4就是造成突變體bshl矮化和脆鞘的BSH1基因。
　　3

4、. BSH1的亞細(xì)胞定位和時(shí)空表達(dá)模式
　　觀察BSH1與GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)BSH1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Marker共定位，說明BSH1蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。定量PCR結(jié)果顯示BSH1在葉鞘中表達(dá)量最高，在根中最低。GUS染色分析表明BSH1在胚芽鞘、葉鞘、莖稈、葉片、根和穗子中都有表達(dá)。胚芽鞘和葉片的橫切可以看到 GUS著色在維管束中，而葉鞘著色則在維管束周圍的細(xì)胞，根中的染色帶與厚壁細(xì)胞重疊。在第一節(jié)間較為幼嫩的部位有較深的染色

5、。成熟組織中也檢測(cè)到了 GUS活性，例如穗軸和小花，而且小花的染色會(huì)隨著小花的成熟擴(kuò)展到整個(gè)穎殼。
　　4. BSH1的功能分析
　　在進(jìn)化上，CYP96家族的成員被分為兩個(gè)分支，一支是包含OsCYP96B4的單子葉分支，另一支是包含AtCYP96AJ5的雙子葉分支。已經(jīng)報(bào)道的CYP96家族的成員的功能多樣，既有負(fù)責(zé)脂肪酸修飾的基因，也有與抗病、抗逆相關(guān)的基因，但是大部分CYP96家族成員的功能未知。
　　脂肪酸成分的

6、檢測(cè)結(jié)果表明bshl蠟質(zhì)總量從野生型950.70膽/g下降到突變體393.16膽/g，詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)每一種蠟質(zhì)成分含量都顯著下降，包括C30-C34的醛類，C29-C41的烷烴，C22-C32的脂肪酸和C26-C30的伯醇。而 bshl中角質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和種子內(nèi)脂肪酸的變化不顯著。這些結(jié)果說明BSH1的功能與超長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物的合成有關(guān)。
　　對(duì)細(xì)胞壁合成基因表達(dá)量的分析結(jié)果顯示，所有被測(cè)基因的表達(dá)量都明顯下降，即BSH1表達(dá)