羊口瘡病毒的分離鑒定及其ELISA檢測方法的建立.pdf

1、羊口瘡又稱羊接觸傳染性膿皰性皮炎,是由羊口瘡病毒引起的綿羊、山羊和某些野生反芻動物的一種常見的接觸性、嗜上皮性傳染病,該病毒也可感染人。羊口瘡病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬,該屬病毒還包括牛丘疹性口炎病毒、假牛痘病毒以及紅鹿、松鼠、海豹副痘病毒。羊口瘡呈世界性分布,近年來發(fā)病率逐年上升,引起人們廣泛關(guān)注。
　　 羊口瘡病毒基因組由雙鏈線狀DNA組成,大約138kbp,編碼132個假定基因；其中羊口瘡病毒B2L基因編碼約42kDa是具

2、有高免疫原性的主要囊膜蛋白,該蛋白與牛痘病毒主要囊抗原p37K同源。人們已根據(jù)保守的B2L基因進(jìn)行羊口瘡病毒的檢測,分子特征描述和進(jìn)化樹分析。隨著羊口瘡流行范圍的日益擴(kuò)大,亟需建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法,對羊口瘡的流行狀況進(jìn)行評估,進(jìn)而為防控羊口瘡提供技術(shù)支撐。基于此,本實驗進(jìn)行了如下研究:
　　 1羊口瘡病毒甘肅株的分離與鑒定
　　 利用HeLa細(xì)胞從甘肅某地發(fā)病綿羊痂皮病例中分離羊口瘡病毒；根據(jù)NCBI羊口瘡病毒B2L基

3、因序列,采用Oligo6.0生物軟件設(shè)計-對特異性引物,PCR擴(kuò)增保守B2L基因；運(yùn)用MEGA4.0.2對獲得羊口瘡病毒株B2L,基因核苷酸序列和其它羊口瘡毒株以及副痘病毒屬其它成員進(jìn)行多序列比對,最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果表明:接種羊口瘡病毒的HeLa細(xì)胞在接種后3～4d內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE),表現(xiàn)為細(xì)胞聚集、融合、圓縮,直至脫落的特征性病變；用設(shè)計的特異性引物對病毒基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳顯示擴(kuò)增出約1137bp的

4、清晰條帶,與目的基因片段長度一致；與參考序列相似性為99％,提交NCBI獲得登錄號HQ694772;系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明分離的羊口瘡病毒屬于Ⅰ支,與羊口瘡病毒吉林分離株親緣關(guān)系近。以上結(jié)果說明成功分離到羊口瘡病毒,將其命名為Orf-GS株。
　　 2羊口瘡病毒B2L重組蛋白的原核表達(dá)及純化
　　 在大腸桿菌Rosetta(DE3)plyS中成功表達(dá)了B2L重組蛋白,并對TPTG濃度、誘導(dǎo)時間和溫度等誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確

5、定溫度28℃、IPTG濃度0.4mmol／L、誘導(dǎo)表達(dá)4h為B2L融合蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件；由于該蛋白以包涵體的形式表達(dá),采用DOC和SKL對包涵體進(jìn)行處理,經(jīng)鎳株純化B2L融合蛋白,SAS-PAGE電泳結(jié)果表明在42 kDa左右獲得純化目的蛋白；免疫印跡結(jié)果分析顯示,該融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性。
　　 3羊口瘡ELISA檢測方法的建立
　　 選用重組B2L蛋白作為包被抗原,探索重組蛋白作為診斷抗原建立間接ELI