雞免疫球蛋白的分離純化及其ELISA檢測方法的建立.pdf

1、雞源疾病種類繁多，隨著養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，對禽病的早期診斷和控制尤顯重要。雞血清中IgG水平的測定，已是臨床免疫檢驗和體液免疫研究的常用指標?？闺uIgG的單克隆抗體與常規(guī)免疫血清相比，具有特異性高，效價穩(wěn)定等優(yōu)點，研制抗雞免疫球蛋白單克隆抗體旨在為多種禽病的診斷提供高質(zhì)量、標準化試劑，對進一步研究雞傳染病具有十分重要的現(xiàn)實意義。 本論文分為兩部分，第一部分主要研究了雞血清免疫球蛋白的分離純化，第二部分主要是建立了檢測鼠抗雞IgG抗

2、體的間接ELISA方法。 應用硫酸銨分步沉淀和乙醇沉淀兩種方法粗提雞血清免疫球蛋白，將兩種方法提取的免疫球蛋白用進行SDS—PAGE電泳檢測，實驗結(jié)果顯示，兩種方法粗提的免疫球蛋白都較純，硫酸銨鹽析獲得的免疫球蛋白得率大，乙醇沉淀粗提的免疫球蛋白得率小。然后將兩種方法粗提的免疫球蛋白過SephadexG-200凝膠柱進一步分離純化雞血清IgG，經(jīng)免疫電泳和SDS-PAGE電泳檢測，純化的IgG達到了電泳純，SDS-PAGE電泳可

3、見純化的雞IgG出現(xiàn)兩條帶，分別為其重鏈和輕鏈，免疫電泳結(jié)果只出現(xiàn)一條帶，純度較高。且得知IgG重鏈(H鏈)的分子量大約為65KD，輕鏈(L鏈)的分子量為25KD。Folin-酚法測得層析蛋白濃度為1mg/mL，滿足了后續(xù)實驗的要求。 用純化的雞血清IgG作為抗原，以皮內(nèi)多點注射大白兔及其昆明系普通小鼠制備兔抗雞IgG免疫血清和鼠抗雞IgG免疫血清。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme LinkedImmunosorbentAss

4、ay)和瓊脂擴散實驗測多克隆抗體效價，兔抗雞血清IgG抗體瓊擴效價達到1:8，ELISA效價達到1:5 12000，鼠抗雞血清IgG抗體瓊擴效價為1:2，ELISA效價為1:128000。 本研究還建立了篩選陽性雜交瘤細胞的間接ELIsA法，通過方陣法優(yōu)化出以下最佳反應條件。雞。IgG包被的間接ELISA篩選方法：抗原最適包被量為0.5μg/mL，陽性和陰性血清稀釋度為1:2000，酶標抗體羊抗鼠IgG-HRP的稀釋度為1:10