動物源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性分析及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus,SA)是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上最常見的病原菌,可引起人和家畜的皮膚軟組織感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、腸炎、腦膜炎、骨髓炎和中毒性休克綜合征等疾病。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用以至濫用,1961年英國出現(xiàn)了第一株對甲氧西林耐藥且mec基因陽性的金黃色葡萄球菌,被稱為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicilin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)。MR

2、SA對所有β-內(nèi)酰胺類抗生素的固有耐藥性及其多重耐藥性已嚴(yán)重影響了獸醫(yī)臨床抗感染的治療,因而對動物源MRSA進(jìn)行耐藥性分析、分布情況及分子流行病學(xué)的調(diào)查勢在必行。本研究通過臨床分離鑒定動物源金黃色葡萄球菌、動物源MRSA檢測及其耐藥性分析及動物源MRSA分子流行病學(xué)調(diào)查,對控制MRSA在人畜間大規(guī)模感染,以及指導(dǎo)臨床獸醫(yī)正確使用抗菌藥進(jìn)行針對性治療,避免抗生素濫用情況的發(fā)生有重要意義,為進(jìn)一步研究動物源MRSA耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

3、　　 1.動物源金黃色葡萄球菌的分離與鑒定及PCR檢測方法的初步建立
　　 采集江蘇南京及周邊地區(qū)部分養(yǎng)殖場及南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院健康動物的鼻拭子或肛拭子,根據(jù)常規(guī)微生物檢測技術(shù)進(jìn)行分離、鑒定,獲得不同動物源金黃色葡萄球菌共156株,作為進(jìn)一步研究用的供試菌株,并且以金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc為靶基因,選擇特異性引物,優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序,對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了DNA測序,從而證實PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為目的基

4、因,通過特異性及靈敏性檢測,建立了快速檢測動物源金黃色葡萄球菌PCR方法,該方法特異性好,靈敏度可達(dá)269pg。
　　 2.動物源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測方法及耐藥性的研究
　　 分別采用頭孢西丁、苯唑西林紙片法及PCR檢測mecA基因法對這156株臨床分離菌進(jìn)行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測,同時,用K-B法對該156株金黃色葡萄球菌進(jìn)行了9種抗生素耐藥性檢測。結(jié)果顯示,頭孢西丁、苯唑西林紙片法及PCR法檢出率分別

5、為21.79、19.87％和16.67％。與作為金標(biāo)準(zhǔn)的PCR法相比較,苯唑西林紙片法的敏感性為96.15％,特異性為93.08％,符合率為93.59％；頭孢西丁紙片法的敏感性為96.15％,特異性為95.38％,符合率為95.51％,經(jīng)x2檢驗藥敏紙片法及PCR檢測法檢測MRSA結(jié)果無顯著性差異,頭孢西丁法操作簡便,且特異性和符合率較高,能夠在基層臨床實驗室常規(guī)開展。所檢出的26株動物源MRSA耐藥率達(dá)0％～100％,其中有相當(dāng)大比例

6、(76.92％)的菌株具有多重耐藥的特點,主要耐受的藥物為氨芐西林(100％)、頭孢噻肟(96.2％)、環(huán)丙沙星(69.2％)和慶大霉素(46.2％)；甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)也存在多重耐藥現(xiàn)象,但其多重耐藥率(36.15％)顯著低于MRSA；本研究未發(fā)現(xiàn)替考拉寧耐藥菌株。
　　 3.動物源MRSA臨床分離株的分子進(jìn)化學(xué)研究

7、r>　　 本研究在國內(nèi)首次應(yīng)用MLST方法和生物信息學(xué)技術(shù)對動物源MRSA株臨床分離株進(jìn)行了分子進(jìn)化學(xué)研究。采用PCR方法擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的tpi、yqiL、arcC、aroE、glpF、gmk和pta7個高度保守的看家基因,對擴(kuò)增的序列片段進(jìn)行DNA序列分析,并將分析結(jié)果提交國際數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站http://www.mlst.net進(jìn)行比對,最終獲得菌株ST分型,并與數(shù)據(jù)庫中的菌株資料以及相關(guān)文獻(xiàn)的菌株資料進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示,26株

8、動物源MRSA臨床分離株共分出20個ST型,其中2009S001、2010S011和2010S024屬于ST-9型,2009M016屬于ST-88型,2010M093屬于ST-188型,2010DC002屬于ST-133型；其余菌株均未在數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)相同ST型,為新ST型。在這些新型菌株中,猴源菌株占95％(19/20),2009S001為豬源占5％(1/20)。本研究對國內(nèi)不同動物源MRSA臨床分離株進(jìn)行了MLST分型,并了解了它們的