甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌ccrAB的表達(dá)調(diào)控機(jī)制.pdf

1、金黃色葡萄球菌（簡(jiǎn)稱金葡菌）是一種重要的人類和動(dòng)物病原體細(xì)菌，能夠引起多種類型的感染性疾病，在臨床上主要通過使用抗生素來進(jìn)行治療。然而隨著耐藥性菌株，特別是甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)的全球性傳播，抗生素治療遇到了前所未有的挑戰(zhàn)。由于獲得了能夠編碼PBP2a這種替代性青霉素結(jié)合蛋白的基因mecA，MRSA菌株對(duì)幾乎所有類型的β內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生了抗性。基因mecA位于一個(gè)可移動(dòng)的遺傳元件SCCmec上，該元件上同時(shí)也攜帶有編

2、碼一套整合酶的基因ccrAB或ccrC，它們編碼的Ccr整合酶參與了SCCmec的剪切和整合，而且ccrAB或ccrC的表達(dá)水平緊密關(guān)聯(lián)著SCCmec元件的穩(wěn)定性及其平行基因轉(zhuǎn)移。早期的研究發(fā)現(xiàn)ccrAB基因只在一小部分的細(xì)胞中有表達(dá)，而且其所占的比例或者ccrAB基因整體的表達(dá)水平可以明顯受到溫度和抗生素等外界因素的影響，說明在ccrAB基因的表達(dá)過程中存在著一套非常精細(xì)的調(diào)控過程，而關(guān)于這一調(diào)控機(jī)理的研究還是一片空白。
　　本

3、課題主要通過以下兩部分的研究對(duì)ccrAB表達(dá)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行闡述，
　　1.輔助性sigma因子在ccrAB轉(zhuǎn)錄以及SCCmec剪切過程中的調(diào)控
　　輔助性sigma因子在金葡菌中介導(dǎo)了多種環(huán)境因子的感應(yīng)以及細(xì)菌細(xì)胞生理過程的調(diào)控，早期的研究也發(fā)現(xiàn)SigH參與了金葡菌中原噬菌體基因組剪切和整合的調(diào)控。這些研究結(jié)果提示我們輔助性sigma因子也有可能參與調(diào)控了SCCmec元件的剪切和整合。在該研究中，我們首先確定了ccrA和cc

4、rB處于同一個(gè)操縱子中，而且它們的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出了明顯的時(shí)相依賴性。我們分別在N315菌株中過表達(dá)了SigB，SigH，SigS三種輔助性sigma因子，結(jié)果顯示SigB的過表達(dá)明顯提高了ccrA基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步的研究也發(fā)現(xiàn)SigB的過表達(dá)能夠明顯提高SCCmec元件的剪切。通過引物延伸實(shí)驗(yàn)和5'RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)我們鑒定出了一個(gè)之前從未被報(bào)道的SigB識(shí)別序列，而且該序列存在于多

5、種SCCmecⅡ型和Ⅳ型的菌株中。
　　2.反向重復(fù)序列以及蛋白調(diào)控因子SarS在ccrAB轉(zhuǎn)錄以及SCCmec剪切過程中的調(diào)控
　　在對(duì)N315菌株中ccrAB基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列分析過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一段反向重復(fù)序列，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)它廣泛存在于不同類型的攜帶ccrAB基因的SCCmec元件中，而且在堿基組成和相對(duì)于ccrA翻譯起始位點(diǎn)的位置上都非常保守。堿基替換相關(guān)的配對(duì)堿基可以明顯提高ccrAB基因啟動(dòng)子的活性，而且無

6、論是替換反向重復(fù)序列的上游配對(duì)部分還是下游配對(duì)部分對(duì)ccrAB基因啟動(dòng)子活性的影響基本一致，說明該段序列是通過一種特殊的空間結(jié)構(gòu)來影響ccrAB的表達(dá)。此外，通過在N315基因組中直接替換該配對(duì)堿基或者通過在ccrAB過表達(dá)質(zhì)粒中替換該部分堿基可以明顯影響SCCmec元件的穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明反向重復(fù)序列在ccrAB基因的表達(dá)以及SCCmec元件的穩(wěn)定性方面起到了無可忽視的作用。通過DNApull-down的方法我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以特異性