稻瘟病菌亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MoMET13)功能的初步研究.pdf

1、本文利用農桿菌介導的ATMT轉化技術成功獲得一個稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)致病缺陷突變體Wh-672,并鑒定了T-DNA標記的基因MoMET13,進而通過敲除和互補驗證對MoMET13的生物學功能做了初步分析。
　　 利用農桿菌介導轉化法(ATMT)篩選出一個對大麥和水稻都完全失去致病性的稻瘟病菌突變體Wh-672。Wh-672在CM培養(yǎng)基上菌落生長速率明顯減慢,菌落白色,無氣生菌絲,不產生分生孢子。采用h

2、iTAIL-PCR的方法擴增了T-DNA右邊界的610bp基因組DNA序列,并克隆到pGEM-Teasy載體上。測序和BLAST分析結果顯示,T-DNA標記基因編號為MGG_01728.6,該基因位于第1染色體的Supercontig27內,由1948個堿基組成,編碼627個氨基酸,內有2個外顯子和1個內含子,T=DNA插入位點在MoMET13基因起始密碼上游815bp處。MGG_01728與Sc MET13和Sp MET9的同源性分別

3、為46.9％,48.03％,這些序列屬于亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)超家族成員。
　　 通過構建MoMET13基因敲除載體和稻瘟病菌原生質體轉化得到96個轉化子,并通過PCR和Southern雜交篩選出4個MoMET13基因敲除轉化子。突變體表型分析結果表明,ΔMomet13突變體不能在缺甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基上生長,對寄主的致病性喪失,其它表型也與Wh

4、-672突變體完全一致。為了進一步驗證突變體Wh-672的表型改變是由T-DNA插入引起的,構建了融合MoMET13和綠色熒光蛋白基因GFP的互補載體,分別對Wh-672和ΔMomet13突變體進行了互補轉化,獲得58個互補轉化子。選取轉化子672-hb3進行表型互補分析,結果顯示突變體的所有表型均得到恢復。通過激光掃描共聚焦顯微鏡在672-hb3的菌絲、孢子和附著胞內幾乎都觀察不到GFP綠色熒光,說明MoMET13基因在營養(yǎng)生長、產孢

5、和附著胞形成過程中低水平表達。
　　 生物信息學分析表明,在稻瘟病菌中除MoMET13外,MoMET12也可編碼亞甲基四氫葉酸還原酶,它們分別與釀酒酵母(S.cerevisiae)的MET13和MET12同源。為進一步了解稻瘟病菌MoMET12基因的功能,通過構建MoMET12基因敲除載體和原生質體轉化得到269個轉化子,用PCR的方法篩選出4個敲除轉化子,ΔMomet12突變體與ΔMomet13突變體類似也不能在缺甲硫氨酸的基