武夷菌素生物合成基因族的克隆及分析.pdf

1、武夷菌素(Wuyiencin)是由不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)產(chǎn)生的一種新型農(nóng)用抗生素,對(duì)多種真菌性病害具有良好的防治效果。采用物理化學(xué)誘變的方法選育武夷菌素高產(chǎn)菌株雖然取得了一些進(jìn)展,但仍不能滿(mǎn)足育種和生產(chǎn)上需要。因此,采用分子生物學(xué)方法提高武夷菌素效價(jià)具有非常重要的意義。本研究構(gòu)建了武夷菌素產(chǎn)生菌基因組文庫(kù),克隆武夷菌素生物合成基因簇并且分析了其功能。此外

2、利用誘變的方法篩選到了武夷菌素生物合成阻斷突變株。結(jié)果如下:
　　 1.采用pCC1FOS為載體構(gòu)建了不吸水鏈霉菌武夷變種基因組文庫(kù),文庫(kù)滴度為8.8×105cfu／ml,文庫(kù)可覆蓋基因組4倍以上。根據(jù)同類(lèi)型抗生素生物合成基因設(shè)計(jì)特異性引物,最終確定以大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)聚酮合成酶基因設(shè)計(jì)的引物篩選基因組文庫(kù)。
　　 2.采用PCR方法對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選得到了三個(gè)陽(yáng)性克隆,對(duì)陽(yáng)性克隆酶切后測(cè)序最終得到了長(zhǎng)度為32509 bp的片

3、段,G+C含量為71.4％,與鏈霉菌基因組高G+C含量的特征相符。生物信息學(xué)分析表明武夷菌素可能是PKSⅠ型抗生素(聚酮類(lèi)化合物),以模塊形式合成。該序列包含5個(gè)完整的ORF(開(kāi)放閱讀框),推測(cè)orf1編碼武夷菌素生物合成起始模塊的酮還原酶(KR)和?；d體蛋白(ACP)；orf2編碼合成過(guò)程中某一模塊的酮合成酶(KS)；orf3長(zhǎng)度為27855 bp,為克隆到的最長(zhǎng)序列,其編碼的蛋白質(zhì)包含5個(gè)聚酮合酶(KS),5個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT),

4、5個(gè)脫氫酶(DH),五個(gè)酮還原酶(KR),1個(gè)烯基還原酶(ER)和5個(gè)?；d體蛋白(ACP),構(gòu)成了合成中的五個(gè)模塊;orf4編碼武夷菌素生物合成中的硫酯酶(TE),參與聚酮長(zhǎng)鏈的環(huán)化和水解；orf5為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,編碼的蛋白質(zhì)屬于LuxR蛋白家族,在轉(zhuǎn)錄過(guò)程起正向調(diào)節(jié)作用。
　　 3.以武夷菌素產(chǎn)生菌CK-15為出發(fā)菌株,通過(guò)誘變處理得到一株喪失抑菌活性且性狀穩(wěn)定的突變株N1。突變株孢子絲為長(zhǎng)螺旋形,孢子呈橢圓形,與出發(fā)菌