井岡霉素與殺念菌素生物合成基因的功能研究.pdf

1、井岡霉素是從吸水鏈霉菌井岡變種5008（Streptomyces hygroscopicusvar. jinggangensis5008）中分離得到的一種弱堿性C7N氨基環(huán)醇類抗生素。它是一種海藻糖酶抑制劑，在中國及東南亞國家被廣泛用在控制水稻葉鞘枯萎病和黃瓜幼苗枯萎病上。井岡霉素生物合成基因簇已被成功克隆并測序，這些序列信息有助于我們研究它的生物合成機(jī)理。
　　 本文在井岡霉素生物合成基因簇中確定了vaIC基因，它編碼的酶與阿

2、卡泊糖生物合成途徑中的2.表-5-表-有效醇酮激酶(AcbM)同源。vaIC的失活使突變株喪失了合成井岡霉素的能力。用攜帶全長vaIC的質(zhì)粒的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)使突變株ZYR-1中井岡霉素的產(chǎn)生得到恢復(fù)。這證明了vaIC在井岡霉素生物合成中的關(guān)鍵作用。VaIC蛋白的體外實(shí)驗(yàn)揭示了ValC是一種新型的C7-環(huán)醇激酶，負(fù)責(zé)磷酸化有效烯酮和有效酮，但不能磷酸化2-表-5-表-有效醇酮、5-表-有效醇酮及葡萄糖。結(jié)果揭示了這個(gè)酶的新活性也證明了阿卡波糖和

3、井岡霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)中共同的有效烯胺結(jié)構(gòu)是通過不同的途徑合成的。
　　 本文還在井岡霉素生物合成基因簇中確定了一個(gè)編碼VOC超家族蛋白的基因vaID。vaID的失活顯著降低了井岡霉素的產(chǎn)量，這種產(chǎn)量的降低可以在互補(bǔ)全長vaID之后恢復(fù)，而互補(bǔ)N端或C端的VaID蛋白只能使產(chǎn)量部分恢復(fù)。異源表達(dá)的VaID負(fù)責(zé)催化2-表-5-表-有效醇酮異構(gòu)生成5-表-有效醇酮。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)VaID的N端區(qū)域有4個(gè)可能的活性位點(diǎn)H44、E10

4、7、H130和E183；C端區(qū)域也有4個(gè)可能的活性位點(diǎn)H229、E291、H315和E366。對VaID蛋白中8個(gè)可能的位點(diǎn)進(jìn)行了單突變或組合突變結(jié)果顯示，N端H44/E107和C端H315/E366比內(nèi)部的4個(gè)氨基酸殘基H130、E183、H229和E291更重要。
　　 我們還對基因簇中的vaIB、vaIK和valO三個(gè)基因進(jìn)行基因置換?；騰aIB編碼一個(gè)可能的核苷轉(zhuǎn)移酶。我們推測VaIB在井岡霉素生物合成中可能負(fù)責(zé)1-表

5、-有效烯醇-1-磷酸的腺苷化。vaIB基因失活突變株喪失了產(chǎn)生井岡霉素的能力，而這種產(chǎn)量的喪失可以在互補(bǔ)全長基因vaIB后得到恢復(fù)。基因vaIK編碼的蛋白與糖異構(gòu)化酶/脫水酶具有顯著的同源性。它可能負(fù)責(zé)5-表-有效醇酮C-5和C-6位的脫水反應(yīng)。vaIK基因失活突變株喪失了合成井岡霉素的能力。這種產(chǎn)量喪失可在互補(bǔ)全長vaIK之后可到恢復(fù)。以上結(jié)果證明vaIB和vaIK是井岡霉素生物合成的必需基因。valO編碼一個(gè)可能的磷酸酶/磷酸變位酶

6、。我們推測它可能負(fù)責(zé)將磷酸基從C-7位轉(zhuǎn)移到C-1位的羥基上。然而，valO基因失活突變株仍能產(chǎn)生井岡霉素，但積累了大量有效氧胺?；パa(bǔ)全長valO之后，突變株中有效氧胺減少而井岡霉素增多。以上結(jié)果暗示了valO可能與有效氧胺和井岡霉素之間的轉(zhuǎn)化有關(guān)。
　　 在一些抗生素產(chǎn)生菌中，對氨基苯甲酸(PABA)和它的前體4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)不僅參與初級代謝中葉酸的合成，也參與次級代謝產(chǎn)物抗生素的生物合成。在殺念菌素產(chǎn)生菌F

7、R-008中對融合的ADC合成酶基因pabAB的缺失使得殺念菌素產(chǎn)量幾乎完全喪失，這種產(chǎn)量的喪失可以通過互補(bǔ)克隆的pabAB或喂養(yǎng)外源PABA得到恢復(fù)。一個(gè)位于PKS區(qū)域上游的可能的IV型PLP依賴性酶的編碼基因pabC-1的失活導(dǎo)致殺念菌素的產(chǎn)量約下降到野生型的20％。用pabC-1對大腸桿菌pabC突變株的成功互補(bǔ)證明了pabC-1與PABA的生物合成相關(guān)。此外，我們從同一菌株中克隆了另一個(gè)可能的IV型PLP依賴性酶的編碼基因pab

8、C-2。pabC-2的失活導(dǎo)致殺念菌素產(chǎn)量約降低到野生型水平的57％。PabC-2對大腸桿菌pabC突變株的成功互補(bǔ)證明了它參與PABA的生物合成。而pabC-1/pabC-2雙突變株幾乎完全喪失了合成殺念菌素的能力，說明pabC-2也參與了殺念菌素的生物合成。令我們吃驚的是，雙突變株在基本培養(yǎng)基上生長明顯延遲，這說明pabC-1和pabC-2都參與了初級代謝中PABA的合成。最后，我們通過檢測丙酮酸的釋放證明了PabC-1和PabC-