武夷菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化及效價(jià)的測(cè)定.pdf

1、武夷菌素是從不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces ahygroscopicus.var．wuyiLensis)發(fā)酵產(chǎn)物中提取研制出的一種具有廣譜抗菌作用的農(nóng)用抗生素，對(duì)多種作物病原真菌有較強(qiáng)抑制作用。為了提高鏈霉菌產(chǎn)生武夷菌素的效價(jià)，本研究對(duì)不吸水鏈霉菌的培養(yǎng)條件和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并建立了高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中武夷菌素含量的技術(shù)。 1. 對(duì)不吸水鏈霉菌產(chǎn)生武夷菌素原有的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行了驗(yàn)證和改進(jìn)：發(fā)酵起始pH

2、值為8.0，溫度為25～28℃，使用菌種的種齡為18～24h，這與之前采用的發(fā)酵條件相近。發(fā)酵時(shí)間由原來(lái)的48h延長(zhǎng)到64h。采用原有的培養(yǎng)基配方進(jìn)行檢驗(yàn)，使用原來(lái)?xiàng)l件和優(yōu)化后條件發(fā)酵，武夷菌素的效價(jià)分別為3515μg/mL和4443μg/mL，可以提高26.4﹪。 2．首先應(yīng)用替代法篩選出淀粉、葡萄糖、玉米粉、豆餅粉、化合物A、B和C、MgSO<,4>、FeSO<,4>、NaCl為武夷菌素發(fā)酵較適宜的碳、氮源和微量元素。然后應(yīng)

3、用部分因子設(shè)計(jì)法對(duì)以上10種營(yíng)養(yǎng)成份進(jìn)行了分析，確定葡萄糖和豆餅粉為影響武夷菌素效價(jià)的關(guān)鍵因子，最后通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼進(jìn)最大響應(yīng)區(qū)域，用中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化葡萄糖(X<,2>)和豆餅粉(x<,4>)的濃度，得到武夷菌素效價(jià)(y)的二次多項(xiàng)式優(yōu)化擬合模型，其為：y=6643.78+687.42x<,2>+275.13x<,4>-824.69x<,2><'2>-122.45x<,2>x<,4>-620.94x<,4>(R=0.8999，P<0

4、.01)。 由該模型求解可知，當(dāng)葡萄糖27.2g/L、豆餅粉31.8g/L時(shí)武夷菌素效價(jià)(y)有最大值。于是按這兩種關(guān)鍵因子的用量配制出優(yōu)化培養(yǎng)基，用菌株S-40(原始效價(jià)4443μg/mL)比較試驗(yàn)測(cè)定表明，在這種優(yōu)化的培養(yǎng)基上武夷菌素的效價(jià)可提高到6643μg/mE，即提高約50﹪3．將配置好的武夷菌素標(biāo)準(zhǔn)品樣品，在200～400nm吸收波長(zhǎng)范圍內(nèi)用紫外掃描儀掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰在254nm。在進(jìn)樣量20μL，流速1.0mL

5、/min和柱溫25℃條件下，先后以純水、乙腈、三氟乙酸、乙酸銨和三氯乙酸的水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)當(dāng)三氯乙酸在1.4g/L時(shí)(pH<'->2.0)效果最好。考慮到pH對(duì)色譜柱的影響，純水流動(dòng)相引起色譜柱塌陷問(wèn)題以及填料直徑對(duì)色譜柱分離效果的影響，最終選擇了填料直徑為5μm耐酸(1

6、272+0.345x(R=0.9994，P<0.01)，這表明在0.2mg/mL～1.6mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。變異系數(shù)為0.43﹪～2.08﹪，回收率為96.59﹪～100.57﹪，于是建立了應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)武夷菌素有效成份的技術(shù)。 利用管碟法中的“一劑量法”進(jìn)行武夷菌素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。以不同濃度武夷菌素抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，濃度的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制武夷菌素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程y=-1.5097+0

7、.1199x(R=0.9948，P<0.01)。結(jié)果表明武夷菌素在20μg/na～μg/mL濃度范圍內(nèi)抑菌圈直徑與濃度的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系。 同時(shí)通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定和分析，建立了管碟法與HPLC法測(cè)定的武夷菌素含量之問(wèn)的多元線性模型，并對(duì)模型進(jìn)行了驗(yàn)證。管蝶法測(cè)定的武夷菌素生物效價(jià)(y)與用HPLC測(cè)得的武夷菌素A、B、C、D組分峰面積之間的多元線性模型為： y=1025.041-0.375A+3.997B-1.072C+0.220D(R