青蒿水楊酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆及功能分析.pdf

1、青蒿素是一種含有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前世界上最有效的瘧疾治療藥物。文章綜述了青蒿素生物合成基本途徑，青蒿素生物合成途徑的關(guān)鍵酶以及青蒿素生物合成分子調(diào)控。水楊酸（Salicylic acid，SA）是重要的植物激素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育上起了非常重要的作用，并與植物的抗病防御密切相關(guān)。異分支酸合成酶（Isochorismate synthase，ICS）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，P

2、AL）是植物水楊酸合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，分別負(fù)責(zé)將分支酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為異分支酸和反式肉桂酸，然后進(jìn)一步合成最終產(chǎn)物水楊酸。
　　前人已有研究，水楊酸處理青蒿能提高青蒿素的含量。本研究利用青蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)青蒿AaICS1和AaPAL1基因進(jìn)行了克隆和序列分析，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)各基因的表達(dá)模式。通過(guò)相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)、RNAi轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)一步分析青蒿AaICS1和AaPAL1基因在水楊酸合成中的作用。希望通過(guò)提高青蒿內(nèi)源水楊

3、酸含量，從而提高轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量。研究取得的結(jié)果如下：
　　1.青蒿AaICS1和AaPAL1基因的克隆與分析。
　　利用擬南芥基因序列和青蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)引物克隆AaICS1（GenBank登錄號(hào)為KP100111）和 AaPAL1（GenBank登錄號(hào)為KP256149）。AaICS1開(kāi)放閱讀框1710 bp，編碼570個(gè)氨基酸，多重序列對(duì)比表明AaICS1翻譯的氨基酸序列與其他的ICS翻譯的氨基酸序列具有較高

4、的相似性。AaPAL1開(kāi)放閱讀框2151 bp，編碼716氨基酸，多重對(duì)比表明AaPAL1翻譯的氨基酸序列與其他PAL翻譯的氨基酸序列具有較高的相似性。Southern雜交用于分析AaICS1和AaPAL1基因的拷貝數(shù)。結(jié)果表明，AaICS1基因在青蒿中為單拷貝，AaPAL1在青蒿中可能為三拷貝。
　　2.青蒿AaICS1和AaPAL1啟動(dòng)子的克隆與分析。
　　利用克隆到的基因序列和青蒿基因組的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)引物克隆AaICS1

5、和AaPAL1的啟動(dòng)子，并對(duì)啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　3.青蒿AaICS1和AaPAL1基因的表達(dá)分析。
　　RT-qPCR結(jié)果顯示，AaICS1和AaPAL1在各個(gè)組織均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，AaICS1在老葉中表達(dá)最高，在根中表達(dá)最低。AaPAL1在幼葉中表達(dá)最高，在根中表達(dá)最低。對(duì)青蒿進(jìn)行不同脅迫處理，結(jié)果表明：AaICS1和AaPAL1基因能夠響應(yīng)傷害、干旱、鹽脅迫和水楊酸處理，處理后基因表達(dá)量顯著提高

6、，這也和啟動(dòng)子作用元件的預(yù)測(cè)相符。
　　4.青蒿AaICS1和AaPAL1基因的原核表達(dá)。
　　構(gòu)建AaICS1和AaPAL1的原核表達(dá)載體pET-30a-AaICS1和pET-32a-PAL1，并在BL21大腸桿菌中表達(dá)，得到與預(yù)測(cè)大小一致的原核表達(dá)蛋白。
　　5.青蒿AaICS1和AaPAL1基因的過(guò)表達(dá)和干擾的遺傳轉(zhuǎn)化。
　　ICS和PAL是植物水楊酸合成途徑中最關(guān)鍵的兩個(gè)酶。為了驗(yàn)證水楊酸生物合成途徑能使