烏頭GGPS基因克隆分析及雙酯型生物堿生物合成途徑分析.pdf

1、附子是毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根加工品，具有回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛等功效，藥用及人工栽培歷史悠久，常被用于亡陽(yáng)虛脫，肢冷脈微，虛寒吐瀉及脘腹冷痛等癥狀，有毒。
　　附子藥用價(jià)值巨大，栽培歷史雖久，但目前生產(chǎn)上仍然采用“山區(qū)育種，壩區(qū)栽培”的傳統(tǒng)生產(chǎn)模式，栽培區(qū)每年引種的種源地都不固定，導(dǎo)致種源混亂及不穩(wěn)定，迄今為止沒有一個(gè)有效成分含量明顯增高的栽培新品種。
　　附子的

2、主要生物活性成分烏頭堿，在生物堿分類中屬于二萜類生物堿，本研究通過(guò)對(duì)二萜類化合物生物合成中的關(guān)鍵酶基因牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶基因(GGPS)進(jìn)行克隆及組織表達(dá)分析，同時(shí)通過(guò)HPLC對(duì)不同生長(zhǎng)期、不同植物組織中主要的藥用活性烏頭堿:雙酯型生物堿（新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿）進(jìn)行含量檢測(cè)，預(yù)測(cè)了GGPS基因的功能，探討了烏頭GGPS基因?qū)τ诟阶又参矬w內(nèi)烏頭堿類生物堿生物合成的作用，為揭示烏頭堿類生物堿生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)，為通過(guò)生物技

3、術(shù)的方法培育具有高烏頭堿含量的附子新品種提供了途徑。本研究主要得到了以下結(jié)果:
　　1、烏頭GGPS基因的克隆:首次從附子種根組培材料中通過(guò)同源克隆的方式，結(jié)合RACE與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆得到了一個(gè)長(zhǎng)為1420bp的cDNA序列，NCBI同源比對(duì)顯示其與芍藥丹參等物種GGPS基因同源性較高，與金盞花(Adonisaestivalis)同源性最高，達(dá)80％; ORF Finder顯示其CDS區(qū)長(zhǎng)為861bp，編碼287個(gè)氨基酸;同源序列

4、多重比對(duì)及分子系統(tǒng)進(jìn)化分析表明其具有GGPS基因共有的2個(gè)多聚異戊二烯基合酶的特異序列“LMHDDLPCMDNDDLRRG”“IGLLFQVVDDILD”，以及全部5個(gè)保守域;預(yù)測(cè)到GGPS蛋白分子質(zhì)量為30.95kDa，等電點(diǎn)為5.24;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示其主要在葉綠體中表達(dá)，線粒體及其他部位也有少量表達(dá);多維結(jié)構(gòu)分析顯示其結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占30.56％，α-螺旋占65.28％，β-折疊占4.17％;結(jié)構(gòu)比較顯示其三維結(jié)構(gòu)具有高度的保

5、守性。
　　2、GGPS基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá):對(duì)所有材料的熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行不同生長(zhǎng)時(shí)期的縱向比較，結(jié)果顯示，目的基因植株的不同生長(zhǎng)時(shí)期都有不同程度的表達(dá)。具體到植物組織，不同植物組織在不同時(shí)期的表達(dá)量不同，表達(dá)峰值時(shí)期也有組織間差異，但總體來(lái)說(shuō)就，其表達(dá)量與植株的生命代謝活動(dòng)的強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系。
　　3、GGPS基因在不同組織中的表達(dá):GGPS基因在各組織中表達(dá)量差異較大。在生長(zhǎng)旺盛期，組織間表達(dá)量比較為葉

6、＞莖＞根＞須根。
　　4、有效成分在不同組織中的含量:在每個(gè)批次的不同組織樣品中都檢測(cè)出了烏頭堿，說(shuō)明了在附子植株中烏頭堿的合成部位并不僅限于根部，而是植株各個(gè)組織都有合成，但含量卻不一樣，從本研究結(jié)果來(lái)看，植株不同組織間烏頭堿含量高低依次為須根＞子須根＞根＞子根＞葉＞莖。
　　5、有效成分在不同生長(zhǎng)時(shí)期的含量:在不同生長(zhǎng)時(shí)期附子烏頭堿含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，不同組織在不同生長(zhǎng)時(shí)期的含量不同，且線性關(guān)系也不一樣，葉和根中含量隨時(shí)

7、間呈先升高后降低的趨勢(shì)，莖中烏頭堿含量一直升高，而須根中的烏頭堿含量隨時(shí)間變化不大。
　　6、GGPS基因與烏頭堿生物合成的關(guān)系:對(duì)于GGPS基因的表達(dá)及烏頭堿含量分析發(fā)現(xiàn)，烏頭堿的合成與目的基因的表達(dá)在植株部位上高度一致，且其表達(dá)強(qiáng)度隨時(shí)間的趨勢(shì)與烏頭堿含量動(dòng)態(tài)變化隨時(shí)間的趨勢(shì)一致，雙變量相關(guān)性分析顯示相關(guān)系數(shù)為0.993，表明在0.01水平上顯著相關(guān)，說(shuō)明了烏頭堿的合成與GGPS基因的表達(dá)密切相關(guān)，從而可以推斷得知烏頭堿的生物