芳香族氨基酸生物合成相關(guān)基因的克隆表達(dá).pdf

1、在我們的工作中,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從大腸桿菌E. coli基因組中克隆到透性酶基因aroP(p)(攜帶自身的啟動(dòng)子),aroP(不攜帶自身的啟動(dòng)子),調(diào)控基因tyrR,轉(zhuǎn)氨酶基因tyrB和天冬氨酸酶基因aspA.并對(duì)它們分別進(jìn)行了串聯(lián)表達(dá)與功能研究.由tyrR基因編碼的TyrR是大腸桿菌芳香氨基酸生物合成和運(yùn)輸途徑中的一種全局性調(diào)控蛋白.控制著包括自身編碼基因tyrR在內(nèi),涉及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成與運(yùn)輸?shù)?個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的

2、轉(zhuǎn)錄,并具有ATP酶活力.arop基因編碼一種跨膜主動(dòng)運(yùn)輸芳香氨基酸的透性酶(AroP),其轉(zhuǎn)錄受TyrR蛋白抑制.aspA基因編碼天冬氨酸(轉(zhuǎn)氨)酶(AspA)、tyrB基因編碼芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(AT).L-天冬氨酸可以作為氨基供體,由AT催化相應(yīng)底物生成L-苯丙氨酸,而前者又能在AspA作用下由延胡索酸和無(wú)機(jī)氨得到.因此,將aspA與tyrB基因串聯(lián)表達(dá),只要提供前體物,就可以同時(shí)或分別得到阿斯巴甜的兩種基本原料.我們以aroP(

3、p)-tyrR,arop-tyrR順序一起克隆到pλP<,R>質(zhì)粒上構(gòu)成雙串聯(lián)表達(dá)載體.并將它們導(dǎo)入E. coliWT5中,用大細(xì)胞法檢測(cè)到它們的表達(dá)并分別測(cè)定了它們的酶活力.結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶aroP(p),aroP基因的菌株吸收苯丙氨酸的能力分別提高到原來(lái)的1.40和1.46倍;攜帶tyrR基因的菌株可以將E. coliWT5 ATP酶活力提高到原來(lái)的1.69倍;攜帶aroP-tyrR的菌株運(yùn)輸苯丙氨酸的能力明顯高于攜帶aroP(p)-t