生長抑素對膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景： 膿毒癥是感染、創(chuàng)傷、大手術(shù)后和休克等常見的并發(fā)癥，是危重患者死亡的重要原因。膿毒癥可導(dǎo)致多臟器的損傷，在這些受損傷的臟器中，肺臟最易受到各種致病因素的打擊，成為機(jī)體失控炎性損害的主要靶器官，這是由于肺臟不僅是氣體交換的器官，也是一些細(xì)胞因子和激素等產(chǎn)生和滅活的場所。各種途徑入血的毒素、內(nèi)源性炎性介質(zhì)等物質(zhì)經(jīng)靜脈回流后首個(gè)流經(jīng)的重要臟器就是肺臟，加上肺臟本身在解剖結(jié)構(gòu)上相對較脆弱，肺循環(huán)具有壓力低、流速慢、面積大的特點(diǎn)

2、，增加了肺臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞對毒性物質(zhì)的暴露機(jī)會和時(shí)間。因此，在諸多臟器中，肺臟也因而成為功能不全發(fā)生率最高和發(fā)生時(shí)間最早的器官，并表現(xiàn)為急性肺損傷或/和急性呼吸窘迫綜合征。 關(guān)于膿毒癥致肺損傷的確切發(fā)病機(jī)制還不清楚，研究認(rèn)為，急性肺損傷不僅是肺部疾病，也是全身系統(tǒng)炎性疾病的肺部表現(xiàn)，炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致多形核白細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活，引起多種促炎細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-α、白介素-1β等釋放，并通過細(xì)胞間的信息傳導(dǎo)，

3、炎性反應(yīng)級聯(lián)放大，導(dǎo)致肺損傷加重、免疫系統(tǒng)功能破壞，甚至發(fā)展為多器官功能障礙綜合征。多形核白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)者和執(zhí)行者，近來研究表明：在巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞上表達(dá)的髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體1作為細(xì)菌和真菌急性炎癥反應(yīng)的觸發(fā)器和放大劑的角色已受到人們的關(guān)注。在細(xì)菌感染早期TREM1在單核細(xì)胞上的活化具有通過參與免疫反應(yīng)來幫助宿主抵抗微生物侵犯的作用，它能誘使幾種炎性因子和化學(xué)因子如腫瘤壞死因子-a、白介素-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-

4、1的生成。在細(xì)胞內(nèi)部，TREM1可激活中性粒細(xì)胞脫顆粒，誘發(fā)鈣離子轉(zhuǎn)移，并使細(xì)胞表面信號相關(guān)激酶1，2和磷脂酶C酪氨酸磷酸化，TREM1連同跨膜受體分子DAP12共同調(diào)節(jié)該活化過程，最終可引起炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)、放大，導(dǎo)致“過度”的炎癥反應(yīng)。在LPS誘導(dǎo)的休克，腹腔注射活的大腸桿菌和盲腸結(jié)扎穿孔的急性細(xì)菌炎癥動物模型中發(fā)現(xiàn)，采用可溶性TREM1IgG融合蛋白阻斷TREM1信號減少過渡的炎癥反應(yīng)和死亡，進(jìn)一步證實(shí)TREM1具有防大炎癥反應(yīng)的作

5、用。而在細(xì)菌感染期間，TREM1還具有促進(jìn)炎性因子分泌的作用，當(dāng)DAP12在肺中持續(xù)的高表達(dá)，TREM1、TREM2分子被誘導(dǎo)出，它們動態(tài)的表達(dá)促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放。這些提示鑒于TREM1在啟動和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，在機(jī)體諸如膿毒癥和急性肺損傷等過度的炎癥反應(yīng)為特征的疾病，TREM1可作為潛在的治療靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)TREM1的信號可以幫助改善膿毒癥和急性肺損傷患者的預(yù)后。 生長抑素及其類似物是臨床治療急性胰腺炎的有效藥物，已有

6、研究提示其對重癥胰腺炎致肺損傷的治療作用機(jī)理與抑制免疫活性細(xì)胞功能及雙向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)有關(guān)。但是對于同是過度炎癥反應(yīng)狀態(tài)的膿毒癥肺損傷，生長抑素是否產(chǎn)生相同的治療作用，而且其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑如何，未見相關(guān)報(bào)道。而近年研究表明細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個(gè)新途徑，JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在組織受傷和感染時(shí)釋放的細(xì)胞因子使其通路中相應(yīng)的因子活化并表達(dá)升高，過度激活JAK-STAT通路誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞生成大量的磷酸化JAK和磷酸化STAT已成為內(nèi)毒素致

7、肺臟損傷機(jī)制的新解釋，但相關(guān)研究不多。所以本研究擬利用小鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)致膿毒癥肺損傷的動物模型，從動物模型和分子水平觀察生長抑素治療膿毒癥肺損傷后氧分壓、肺濕/干比、髓過氧化物酶(MP0)、病理學(xué)指標(biāo)以及細(xì)胞因子TNF-α的變化，并觀察TNF-α、IL-1β及TREM1的基因表達(dá)變化、TREM1蛋白表達(dá)水平以及JAK-STAT的信號通路變化，旨在闡明生長抑素治療膿毒癥肺損傷的機(jī)制，為膿毒癥肺損傷的預(yù)防和臨床救治提供一種新的研究思路。

8、 研究目的： 1.觀察生長抑素對膿毒癥致肺損傷小鼠血氧分壓、肺濕干比、肺髓過氧化物酶(MPO)、炎性細(xì)胞因子TNF-α水平及肺組織病理的影響，探討生長抑素對膿毒癥肺損傷的保護(hù)性作用。 2.觀察生長抑素對膿毒癥肺損傷小鼠肺組織TREM1、TNF-α、IL-1β基因表達(dá)及TREM1蛋白表達(dá)水平的影響，在分子水平探討生長抑素對膿毒癥肺損傷的保護(hù)機(jī)制。 3.觀察生長抑素干預(yù)對膿毒癥肺損傷小鼠肺組織Jak-Stat信

9、號通路的影響，旨在探討生長抑素對膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 研究內(nèi)容： 第一部分：生長抑素對膿毒癥小鼠肺損傷的保護(hù)作用 采用盲腸穿孔方法復(fù)制膿毒癥肺損傷模型。50只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為5組：正常對照組，假手術(shù)組，膿毒癥組，生長抑素治療1組，生長抑素治療2組，每組10只。生長抑素1組小鼠ALI后0h、6h時(shí)間點(diǎn)皮下注射生長抑素50mg/kg(濃度5mg/ml)，生長抑素2組為100mg/kg(濃度10mg

10、/ml)，其余組小鼠注射等量的生理鹽水。于模型成功后12h點(diǎn)，采用左心室穿刺采集小鼠動脈血測定血氧分壓；采用4％中性福爾馬林液固定肺組織，進(jìn)行HE染色后進(jìn)行病理評分；采用ELISA法檢測12h血漿TNF-α水平；采用分光光度比色法測定肺組織髓過氧化物酶的活性。 第二部分：生長抑素對膿毒癥肺損傷小鼠TREM1表達(dá)的影響 膿毒癥肺損傷模型同第一部分，在致傷后12小時(shí)取材，處理標(biāo)本。Trizol法提取肺組織總mRNA后，RT-

11、PCR分析TREM1、TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠肺灌洗液中中性粒細(xì)胞表面TREM1蛋白的表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測各組小鼠肺組織TREM1的表達(dá)，并采用光密度軟件分析小鼠肺組織TREM1的表達(dá)變化；全細(xì)胞裂解法提取各標(biāo)本總蛋白后，Westernblot法檢測各組肺組織中TREM1蛋白總含量；結(jié)合第一部分肺濕干比、髓過氧化物酶的活性，進(jìn)行相關(guān)分析。 第三部分：生長抑素對膿毒癥肺損傷小鼠Jak-

12、Stat信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 采用盲腸穿孔方法復(fù)制膿毒癥肺損傷模型。9只昆明雄性小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組，膿毒癥肺損傷組，生長抑素治療組，每組3只。生長抑素組小鼠ALI后0h、6h時(shí)間點(diǎn)皮下注射生長抑素100mg/kg，濃度10mg/ml)，其余小鼠注射等量的生理鹽水。于模型成功后12h點(diǎn)，處死小鼠獲取肺組織液氮保存用于基因芯片測定Jak-Stat信號通路的基因表達(dá)差異。 研究結(jié)果： 第一部分：生長抑素對膿毒癥肺

13、損傷小鼠的肺保護(hù)性作用 各組小鼠12h時(shí)點(diǎn)氧分壓數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示組間氧分壓差異有顯著性(F=16.038，P=0.000)。進(jìn)一步經(jīng)組間多重比較LSD法分析，結(jié)果顯示與正常對照組(99.4±8.5)和假手術(shù)組(98.5±6.6)相比，生長抑素治療SS1組(89.2±8.7)PaO2降低差異有顯著性(P<0.01)，SS2(93.3±7.1)組小鼠PaO2稍低，但差異無顯著性(P>0.05)；而與ALⅠ組相比，SS1

14、及SS2治療組小鼠PaO2升高差異有顯著性(P<0.01)，提示不同治療方法隨組別的不同，PaO2變化不同。說明ALI致傷小鼠以后，發(fā)生肺間質(zhì)水腫以及肺泡上皮損傷，從而影響氣體交換，導(dǎo)致血氧下降，而SS治療則具有提高膿毒癥肺損傷時(shí)PaO2的作用。 第二部分：生長抑素治療肺組織TREM1、TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)的影響 經(jīng)單因素方差分析及組間多重比較LSD法分析，結(jié)果顯示與Ctrl組(0.065±0.035)和S

15、ham組(0.067±0.032)小鼠肺組織TREM1mRNA表達(dá)比較，生長抑素治療SS1組(0.400±0.033)及SS2組(0.374±0.037)表達(dá)升高差異有顯著性(P<0.01)，而與ALⅠ組(0.596±0.066)比較，SS1、SS2組表達(dá)下降差異有顯著性(P<0.01)。提示膿毒癥肺損傷12h時(shí)點(diǎn)TREM1mRNA表達(dá)升高，而生長抑素具有抑制TREM1基因轉(zhuǎn)錄的作用。 第三部分：生長抑素對膿毒癥肺損傷小鼠Jak

16、-Stat信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 通過膿毒癥術(shù)后12h肺組織的基因芯片分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)膿毒癥術(shù)后12h，有57個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)者40個(gè)，下調(diào)者17個(gè)。其中涉及到JAK/STAT通路的基因、耦聯(lián)及激活Jak蛋白的受體、核轉(zhuǎn)位、Stat蛋白磷酸化、轉(zhuǎn)錄正性/負(fù)性調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)激活、免疫反應(yīng)、凋亡等。從上調(diào)及下調(diào)基因功能的差別看，上調(diào)基因如Jak2、Cxc19、I120、Nos2、Stat1、Stat3等主要是正性調(diào)節(jié)

17、信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活、炎癥反應(yīng)、抗凋亡基因等基因，下調(diào)基因主要是負(fù)性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的激活、促進(jìn)凋亡的基因、抑制免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的基因等。上游信號通路不同功能的轉(zhuǎn)錄信號差異從一定程度上啟動了下游促炎細(xì)胞因子的信號的轉(zhuǎn)位、復(fù)制，轉(zhuǎn)錄激活的不同，導(dǎo)致了促炎細(xì)胞因子與抑炎細(xì)胞因子的不平衡，這可能是膿毒癥機(jī)體促炎因子與抗炎因子之間的平衡發(fā)生變化的根本原因。 結(jié)論： 生長抑素能明顯抑制膿毒癥肺損傷小鼠肺中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞表面髓樣細(xì)胞觸