雞傳染性支氣管炎病毒廣西分離株的致病性研究及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV基因組十分容易發(fā)生變異，導(dǎo)致病毒的基因型、血清型、致病性、免疫原性等發(fā)生變異，給本病的防控帶來(lái)很大的困難。
　　 近年來(lái)對(duì)IBV的分型研究很多，但對(duì)致病性沒(méi)有做進(jìn)一步的研究，更沒(méi)有研究致病性和基因組

2、變異之間的關(guān)系。結(jié)合IBV基因變異的情況，研究其在感染組織中的動(dòng)態(tài)分布情況、消長(zhǎng)規(guī)律和組織親嗜性變化，揭示IBV分子變異機(jī)理，是目前冠狀病毒研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)第3群禽冠狀病毒的宿主范圍有擴(kuò)大的趨勢(shì)，除雞、火雞外，野鴿和家鴿等均可感染，但目前缺乏雞源冠狀病毒對(duì)鴿的致病性研究。目前檢測(cè)IBV的方法眾多，但存在無(wú)法定量的缺陷，病毒的定量檢測(cè)對(duì)致病機(jī)理、免疫機(jī)理、防控效果的研究都具有重要意義。針對(duì)這些問(wèn)題，本研究進(jìn)行了IBV的致病性試驗(yàn)以及建立

3、IBV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。
　　 首先，在本課題組對(duì)26個(gè)廣西IBV分離株進(jìn)行基因分型將其分為4個(gè)基因型的基礎(chǔ)上，從中選擇代表4個(gè)不同基因型的9個(gè)廣西IBV分離株進(jìn)行人工感染雛雞的試驗(yàn)。結(jié)果表明，4個(gè)基因型的廣西流行毒株對(duì)非免疫雛雞均具有致病能力，潛伏期為24h至48h，發(fā)病率88.8％至100％；基因型I（與H120親緣關(guān)系很遠(yuǎn)）的GX-YL5、GX-C、GX-YL9、GX-NN1和GX-NN6能引起試驗(yàn)雞死亡

4、，死亡率可達(dá)11.1％-44.4％，并引起呼吸系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的病變；試驗(yàn)雞可帶毒和通過(guò)泄殖腔排毒42天。而與H120親緣關(guān)系很近或與4/91親緣關(guān)系很近的廣西分離株未能引起試驗(yàn)雞死亡。
　　 第二，應(yīng)用本課題組建立的套式RT-PCR對(duì)人工感染GX-YL5分離株的雛雞不同臟器中的病毒進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)和組織病理學(xué)觀察。結(jié)果表明肝臟和肺帶毒19天，胸腺和腺胃帶毒21天，盲腸扁桃體和氣管連續(xù)帶毒26天，腎臟帶毒長(zhǎng)達(dá)40天，感染雞帶毒和排毒持

5、續(xù)時(shí)間可達(dá)42天；病毒能引起氣管分泌粘液、氣管和細(xì)支氣管纖毛脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺充血、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致腎臟發(fā)生間質(zhì)性腎炎以及法氏囊水腫。結(jié)果顯示該毒株不但致病力強(qiáng)，排毒時(shí)間長(zhǎng)，而且具有廣泛的組織嗜性，能引起多個(gè)器官組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。
　　 第三，選擇對(duì)雞致死率最高的分離株GX-YL5及與鴿源冠狀病毒S1基因高變區(qū)同源性很高的分離株GX-YL2對(duì)鴿子進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示GX-YL2和GX-YL5分別引起50％和25％鴿子出現(xiàn)

6、呼吸道癥狀，并可以在鴿子體內(nèi)迸行增殖，帶毒28天，但通過(guò)泄殖腔排毒不明顯：鴿子感染IBV的解剖病變包括氣管分泌粘液，肺出血，胰臟出現(xiàn)水腫及炎癥，組織切片觀察見(jiàn)到胰腺中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫，氣管上皮細(xì)胞腫脹，肺出血等。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程未見(jiàn)到致鴿子死亡。表明了對(duì)雞具有較強(qiáng)致病能力的雞源IBV可以感染肉鴿，能在肉鴿體內(nèi)不同組織中增殖，對(duì)肉鴿有一定的致病力，但對(duì)鴿子致病力不強(qiáng)。
　　 第四，為了更好地研究IBV的病毒載荷量與致病機(jī)理、免疫機(jī)理

7、、防控效果的關(guān)系，本課題建立了靈敏度高、特異性強(qiáng)、可重復(fù)性好的SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該方法最小可以準(zhǔn)確檢測(cè)到10拷貝/μL的目的基因，常見(jiàn)禽類(lèi)病毒NDV、IBDV、ARV和ILTV均不能擴(kuò)增。為本課題下一步的免疫原性試驗(yàn)提供很好的技術(shù)工具。
　　 綜上所述，本課題研究結(jié)果表明，與H120親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的廣西IBV分離株對(duì)易感雛雞有較強(qiáng)的致病能力，但對(duì)鴿子致病力比較弱；建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR