雞傳染性支氣管炎病毒陜西分離株N基因的克隆與分子遺傳變異研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、由傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Vires,IBV)引起的雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis,IB)是高度傳染的全球性雞病之一,嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)。IBv眾多的血清型及其基因組的不斷變異給IB的免疫防控帶來很大的困難。由IBV變異引起的疫苗免疫失敗現(xiàn)象越來越多。IBV N基因及其編碼蛋白在病毒RNA的復制、包裝、核衣殼的形成、誘導體液免疫和細胞免疫應答等方面有重要意義。本研究對8株

2、IBV陜西分離株的N基因的遺傳變異進行了研究,目的是從分子水平上探索我國IB疫苗免疫失敗的原因,并對N基因及其編碼蛋白在IBV抗體水平監(jiān)測、診斷和IBV基因工程疫苗等方面的應用進行了初探。研究內(nèi)容如下: 1.用RT-PCR方法對8個IBV陜西分離株(WH、YX、YL、BJ、WG、G5、FF2、B01)的N基因進行了擴增,各擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序后與GenBank登錄的7個IBV參考毒株的N基因進行核苷酸序列、氨基酸序列和系統(tǒng)進化樹

3、比較分析。結(jié)果表明,IBV陜西分離株與參考毒株的同源性差異較大(85.5%~87.3%),所有分離株N蛋白突變均以散在的點突變形式為主,其變異與組織嗜性無明顯相關(guān)性;分離株WH、YX和YL與參考毒株Ark99及Gray在同一進化分支上,差異較小;而BJ、WG和G株則形成一個獨立的進化分支,與我國疫苗毒株W93、H120及其他參考毒株差異較大;B01株與M41株在進化上接近,與Beaudette株、EP3株在同一進化分支;FF毒株與其他毒

4、株N蛋白差異最大,排在進化樹最始端。實驗結(jié)果提示,我國IBV地方分離株N基因變異有不斷加大的趨勢。 2.IBV陜西分離株G5(W118)已作為我國動物疫苗生產(chǎn)企業(yè)--楊凌綠方生物工程有限公司IBV多價滅活苗的制苗毒株之一,該滅活苗對于預防腎變型IB有明顯效果。為了從分子水平上揭示W(wǎng)118株的遺傳背景和免疫效果,用RT-PCR方法擴增了W118株S1、M和N基因,經(jīng)克隆和測序后與GenBank登錄的IBV參考毒株進行序列比較分析。

5、結(jié)果表明,IBV W118株S1基因及N基因與14個參考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為71.0%~85.3%和72.7%~83.9%及84.1%~95.7%和88.9%~96.1%,M基因與12個參考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為86.6%~98.1%和89.8%~98.2%;W118株的S1蛋白與IBV疫苗株H52、H120比較,在25aa位缺失一個氨基酸,73aa位插入了(T-N-G-N-D-V-G)7個氨基酸,其它

6、區(qū)域存在多個點突變;S1蛋白潛在糖基化位點分析顯示W(wǎng)118株與美國腎型Gray株、英國變異株793B在潛在糖基化位點上有相似性;W118株M蛋白在61aa,204aa,222aa出現(xiàn)了點突變,N蛋白在175~241aa抗原區(qū)域出現(xiàn)了5個點突變,這可能影響到此抗原區(qū)域的B細胞表位。W118株S1、M和N基因的缺失、插入和點突變,揭示了當前IBV弱毒疫苗H120、H52及W93臨床保護力差的分子機制。 3.運用生物信息軟件對IBV W118

7、株N基因蛋白的二級結(jié)構(gòu)特點及抗原性進行了分析。結(jié)果表明,IBV W118株N蛋白的氨基酸組成和二級結(jié)構(gòu)特點使其有利于與RNA結(jié)合,N蛋白的抗原性好并存在多個B細胞優(yōu)勢表位,與已鑒定的B細胞表位相比位置更明確。構(gòu)建了W118株N基因原核表達載體N-pET32a,轉(zhuǎn)化并篩選陽性克隆進行誘導表達,SDS-PAGE和Western-blotting檢測表明,高量表達的N蛋白具有良好的反應原性,可用于IBV的診斷,為IBV ELISA檢測試劑盒的

8、開發(fā)提供了材料。 4.重新設(shè)計一對引物擴增W118株N基因,將其PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體后,切下目的片段插入到復制型DNA疫苗載體pSCA1。BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定和序列測定結(jié)果表明,得到了N基因自殺性DNA免疫質(zhì)粒W118N-pSCA1,這為進一步研究IBV N基因DNA疫苗提供了素材。有關(guān)W118株N基因自殺性DNA疫苗與S1基因的DNA疫苗或IBV分離株滅活苗的聯(lián)合應用正在試驗之中。 從本研究的結(jié)果

9、來看,8株IBV陜西分離毒N基因核苷酸及氨基酸序列均發(fā)生了一定的變異,并與我國疫苗株H120、H52和W93有較大差異,這也許是近年來我國IB疫苗免疫失敗的原因之一。IBV W118株主要結(jié)構(gòu)基因(特別是S1基因)的序列分析,揭示了其作為滅活苗制苗毒株能有效預防腎型IBV地方流行強毒株的分子機制以及H120、H52和W93弱毒株在IB臨床免疫預防上的缺陷。本研究不僅為新型IBV基因工程疫苗的開發(fā)提供了理論依據(jù),而且也豐富了我國IBV的分

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