家蠶微孢子蟲serpinNBO_39gi001基因的表達定位及serpin的功能初探.pdf

1、微孢子蟲(microsporidia)是一類專性細胞內寄生的單細胞真核生物，能感染幾乎所有的無脊椎動物和脊椎動物，包括人類，是經(jīng)濟昆蟲、魚類、兔類、產(chǎn)毛動物、嚙齒類及靈長類的常見病原，目前已發(fā)現(xiàn)約有150個屬，1400余種。家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)是人類最早發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲，主要寄生于經(jīng)濟昆蟲家蠶，是家蠶微粒子病的病原，因其可以通過胚種垂直傳播，因而危害巨大，被列為蠶業(yè)生產(chǎn)上的法定檢疫對象。我國是一個養(yǎng)蠶大國，每年因

2、微粒子病和帶毒種造成的經(jīng)濟損失高達上千萬元，因此，研究家蠶微孢子蟲具有重要的理論意義和實踐意義。事實上，攻克家蠶微粒子病一直是蠶業(yè)研究的重點和難點，特別是如何能夠在家蠶發(fā)病的早期發(fā)現(xiàn)并及時采取相應措施，使損失降到最低是目前十分受關注的熱點。
　　 本實驗室完成了家蠶微孢子全基因組測序及框架圖的繪制，為家蠶微孢子的研究提供了信息基礎。通過生物信息學分析，我們鑒定出一個家蠶微孢子蟲serpin型絲氨酸蛋白酶抑制物基因家族，并在已報道

3、的微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)中進行檢索，發(fā)現(xiàn)蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)中也有serpin基因。Serpin基因在多數(shù)生物進程中發(fā)揮著不同的功能。在生物的進化過程中，病原生物采用特殊的策略逃避宿主的防御機制，已有報道，發(fā)現(xiàn)寄生物的serpin能抑制宿主的免疫反應。家蠶微孢子蟲有可能分泌serpin蛋白，抑制宿主免疫防御反應中的絲氨酸蛋白酶，下調免疫反應，從而成功寄生于家蠶體內。本研究旨在已有的信息基礎上，鑒定家蠶微孢子蟲的serp

4、in基因，對其功能進行探索，為家蠶微孢子蟲與宿主間的互作研究提供參考。
　　 本研究利用生物信息學分析，鑒定出家蠶微孢子蟲的serpin基因家族，然后通過轉錄譜分析，選擇其中一條serpin基因序列，進行克隆、原核表達及膠體金免疫電鏡定位分析，同時對獲得的可溶性表達蛋白進行了功能分析。主要研究結果如下：
　　 1.家蠶微孢子蟲serpin家族的序列及轉錄譜分析從家蠶微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫中，通過生物信息學分析，共鑒定了12

5、個serpin，將這12條序列與其他物種的serpin進行多重序列比對發(fā)現(xiàn)，家蠶微孢子蟲與其它物種的serpin相似性低，然后對serpin RCL區(qū)鉸鏈區(qū)進行分析，NBO_34g0030，NBO_42g0004，NBO_18g0021，NBO_18g0004，NBO_372g0002，NBO_34g0036，NBO_19g0009的P16-P9氨基酸殘基都發(fā)生了很大的突變，說明它們可能是非抑制型serpin。
　　 對家蠶微孢

6、子蟲serpin蛋白P1位點的預測發(fā)現(xiàn)，NBO_124g0001，NBO_1569g0001，NBO_19g0007，NBO_1570g0002，NBO_19g0009，NBO_372g0002，它們的P1位點預測都是天冬氨酸；NBO_18g0004和NBO_34g0036的P1位點都是谷氨酸，目前還不能推測這8條serpin蛋白可能的靶標；NBO_34g0030，NBO_42g0004的P1位點是苯丙氨酸，NBO_39gi001 P1

7、位點是酪氨酸，這3個serpin蛋白可能以胰凝乳蛋白酶為靶標；NBO_18g0021預測P1位點為賴氨酸，可能的靶標為胰蛋白酶。
　　 為了分析感染家蠶后家蠶微孢子蟲serpins的轉錄情況，我們對四齡起蠶的家蠶添食微孢子蟲，取感染后1-7天的中腸組織做RT-PCR。轉錄譜分析表明，serpin NBO_1570g0002在添食后1-7天都有轉錄活性，NBO_18g0004，NBO_39gi001分別在4-7天，5-7天有轉錄活

8、性，說明這兩個serpin蛋白很有可能在侵染后期發(fā)揮作用；而NBO_372g0002，NBO_34g0030分別在第7天，第5天有轉錄活性，轉錄活性沒有規(guī)律性。綜合生物信息學分析及轉錄譜結果，推測分泌型serpinNBO_1570g0002，NBO_39gi001有可能參與家蠶微孢子蟲與宿主家蠶的互作。
　　 2.家蠶微孢子蟲serpin基因NBO_39gi001克隆及原核表達在信息分析的基礎上，結合轉錄譜分析的結果，選擇ser

9、pin NBO_39gi001，進行克隆、構建表達重組載體pGEX4T-1-NBO_39gi001，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了目的蛋白，切膠純化蛋白免疫小鼠制備抗血清，用家蠶微孢子蟲的總蛋白作為抗原，western blotting檢測，結果出現(xiàn)了一條特異性條帶，但與預測的大小不符合，推測其原因可能是serpin與靶標形成了復合物。
　　 3.家蠶微孢子蟲serpin蛋白的定位及功能初探采用免疫膠體金電鏡技術來確定serpin

10、NBO_39gi001蛋白表達的特異性及定位特點，結果在成熟孢子的胞原質有膠體金顆粒分布，說明serpin NBO_39gi001在成熟孢子中有表達。
　　 目前，原核表達的3個serpin融合蛋白-GST-NBO_372g002、GST-NBO_1570g0002和GST-NBO_39gi001，只有GST-NBO_1570g0002有可溶性表達蛋白，因此，將原核表達可溶的GST-NBO_1570g0002作為研究對象，對其功

11、能進行分析。結果發(fā)現(xiàn)GST-NBO_1570g0002不能抑制家蠶血液中的酚氧化酶級聯(lián)反應(PO級聯(lián))；也不能抑制絲氨酸蛋白酶Subtilisin及蛋白酶K，推測可能的原因是：第一，家蠶微孢子蟲屬于真核生物，表達的蛋白要經(jīng)過修飾，而原核表達系統(tǒng)沒有蛋白修飾，因此原核表達的GST-NBO_1570g0002沒有活性；第二，serpin型絲氨酸蛋白酶抑制物功能多樣，GST-NBO_1570g0002可能并不參與抑制宿主的PO級聯(lián)反應；第三，