家蠶成品卵微孢子蟲(chóng)McAb-ELISA檢測(cè)方法的研究.pdf

1、家蠶微粒子病(Pebrine disease)是由家蠶微孢子蟲(chóng)(Nosema bombycis簡(jiǎn)稱Nb)寄生而引起家蠶疾病，是一種分布很廣的傳染性蠶病，由于其特殊的經(jīng)卵傳染方式，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，也是蠶種生產(chǎn)上唯一的檢疫對(duì)象。目前生產(chǎn)上實(shí)行母蛾檢驗(yàn)制度，淘汰有毒母蛾所產(chǎn)蠶卵，以供應(yīng)“無(wú)毒"蠶種，從而保障了蠶業(yè)生產(chǎn)的安全。而成品卵檢驗(yàn)檢疫作為“補(bǔ)正檢查”的方式，近幾年也得到廣泛關(guān)注和作為農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)的備檢項(xiàng)目，現(xiàn)行生產(chǎn)中的母蛾檢驗(yàn)和成

2、品卵檢驗(yàn)主要用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行的。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和生產(chǎn)實(shí)際需要，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行家蠶微粒子病檢測(cè)實(shí)用技術(shù)的開(kāi)發(fā)，也是業(yè)內(nèi)十分關(guān)注的問(wèn)題。口岸系統(tǒng)對(duì)進(jìn)出口蠶種承擔(dān)著較大的責(zé)任，目前采用的仍然是顯微鏡鏡檢法，存在一定風(fēng)險(xiǎn)。研究開(kāi)發(fā)一種基于免疫學(xué)技術(shù)，能用于家蠶產(chǎn)品進(jìn)出口中家蠶微粒子病檢疫的方法是必要的。 抗Nb孢子表面蛋白的多抗識(shí)別抗原表位多，但與單抗相比，存在交叉反應(yīng)和靈敏度低等問(wèn)題。本試驗(yàn)利用多抗識(shí)別抗原

3、表位較多、容易捕獲孢子和單抗對(duì)Nb孢子特異性較強(qiáng)的特點(diǎn)，通過(guò)將酶直接標(biāo)記于單克隆抗體上，意圖獲得一種簡(jiǎn)單實(shí)用的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。 用純化的家蠶微孢子蟲(chóng)抗兔多抗包被，作為捕獲抗原，加入檢測(cè)樣品，然后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體作為檢測(cè)抗原，建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)各步實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。 研究表明，用液氮凍融加研磨的方法對(duì)微孢子蟲(chóng)進(jìn)行處理后，包被效果顯著提高。制備的單抗經(jīng)western blot

4、ting驗(yàn)證，識(shí)別的是孢子的表面抗原。多抗最適包被濃度為10μg/ml，最適包被條件為4℃過(guò)夜，酶標(biāo)二抗工作濃度為1:2 000，待檢樣品和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間分別為37℃ 1.5h和1h，底物于37℃顯色15min。 用所建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行了靈敏度檢測(cè)，結(jié)果顯示：對(duì)純化孢子的檢測(cè)量為3.125×105 spores/ml，對(duì)“添毒"蠶卵的檢測(cè)量為5×106 spores/ml?？梢杂糜趯?shí)際生產(chǎn)中的檢測(cè)，靈敏度