微孢子蟲的起源與進(jìn)化及PCR快速檢測家蠶微粒子病.pdf

1、微微孢子蟲（Microsporidia）是一類廣泛存在的，極其古老的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原生生物，能感染從無脊椎動物到人的幾乎所有的動物，是許多昆蟲、魚類、皮毛動物、嚙齒類的重要病原。目前已發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲種類超過1500 種，分別劃入約120 個屬。能感染家蠶的有微粒子屬（ Nosema），具褶孢蟲屬（Pleistophora），泰羅漢孢蟲屬（Thelohania），內(nèi)網(wǎng)蟲屬（Endoreticulatus）等，其中Nosema 屬是微孢子

2、蟲中最具有代表性的屬之一，它的主要宿主是昆蟲，也與某些有免疫性疾病的人的創(chuàng)傷性角膜炎有關(guān)聯(lián)。家蠶微孢子蟲（Nosemabombycis）不僅是有記載以來人類最早發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲，更是Nosema 屬的典型種，由它寄生家蠶所產(chǎn)生的蠶病，稱為家蠶微粒子病。微粒子病是一種重要的蠶病，是世界上所有養(yǎng)蠶國家的檢疫對象。由于其特殊的經(jīng)卵傳染方式，往往對蠶業(yè)生產(chǎn)，尤其是蠶種生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失。盡管微孢子蟲是一種真核生物，但是它們?nèi)鄙僖话惚徽J(rèn)為是真核生物

3、所特有的特征，因此它曾被認(rèn)為是第一個從真核生物分化出來的。但近年來的許多研究結(jié)果表明微孢子蟲與真菌特別是子囊菌關(guān)系相近。本文通過克隆3 種Nosema 屬（Nosema bombycis，Nosema antheraea，Nosema sp.）和未進(jìn)行分類鑒定的3 種Microsporidium 屬(Microsporidium sp.1，Microsporidium sp.2，Microsporidium sp.3)微孢子蟲及兩種家蠶

4、常見的真菌病病原白僵菌（Cordyceps bassiana strain01）和黃僵菌（Cordyceps bassiana strain02）的beta-tubulin 基因，采用MEGA, Phylip, treeview, Mr.bayes 等系統(tǒng)發(fā)育軟件和Neighbour-Joining, Maximum Likelihood, Bayesian methond 等方法進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。 為了建立利用PCR 快速診

5、斷家蠶微粒子病的技術(shù)，根據(jù)Nosema 屬微孢子蟲的ssu rRNA 序列，設(shè)計了一對通用引物，能對Nosema 屬所有微孢子蟲進(jìn)行特異性擴(kuò)增，另外根據(jù)Nosema bombycis 的變異區(qū)域，設(shè)計了一對特異性引物，理論上只能對Nosema bombycis 進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并且設(shè)計了相應(yīng)的PCR 反應(yīng)體系。將該技術(shù)體系應(yīng)用于蠶卵的微粒子病檢測，結(jié)果顯示具有良好的特異性和靈敏度。 本文首先介紹了微孢子蟲作為一種在分類地位上有爭

6、議的物種，其獨(dú)特的一些特征，以及學(xué)術(shù)界對于微孢子蟲進(jìn)化研究的一些重點(diǎn)和熱點(diǎn)。 然后，介紹了本文實(shí)驗(yàn)材料，6 種微孢子蟲和2 種真菌的來源以及基因組DNA的提取方法，引物設(shè)計，PCR 反應(yīng)條件，載體連接，測序，序列登陸等一系列操作手段和方法。 其次，通過MEGA,PHYLIP,Mr.Bayes 等生物信息學(xué)軟件和Neighboyr-Joining，Maximum Likelihood，Bayesian 等方法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育

7、樹，研究微孢子蟲的系統(tǒng)發(fā)育。 最后，構(gòu)建一套PCR 檢測蠶卵微粒子病的體系，為口岸檢測提供技術(shù)支持。 主要得出了以下結(jié)論：3 種未進(jìn)行分類鑒定的Microsporidium 微孢子蟲的beta-tubulin 核苷酸序列與已知的Nosema 屬微孢子蟲同源性達(dá)到98％以上，應(yīng)歸屬于Nosema 屬；本實(shí)驗(yàn)研究的6 種微孢子蟲最后的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示藍(lán)葉蟲微孢子蟲在系統(tǒng)進(jìn)化圖上與其它幾種分成2 支，顯示有一定的差異，可能是因

8、為其寄主為鞘翅目昆蟲，與其它幾種有一定的差別，導(dǎo)致其產(chǎn)生分化；系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果證實(shí)微孢子蟲確實(shí)與接合菌關(guān)系緊密，特別是幾類寄生性與微孢子蟲相似的蟲生真菌；家蠶病原真菌白僵菌和黃僵菌在外形，顏色上有區(qū)別，但是從本文研究結(jié)果上看，其核苷酸序列高度重合，應(yīng)為同屬，黃僵菌很可能是白僵菌的變種和PCR 檢測中根據(jù)Nosema 屬微孢子蟲的ssu rRNA 設(shè)計一對通用引物，能對Nosema微孢子蟲進(jìn)行特異性擴(kuò)增，另外本文根據(jù)Nosema bomby