家蠶微孢子蟲孢壁蛋白的分離及主要組分的表達(dá)譜分析.pdf

1、微孢子蟲(Protozoan：Mifrosporidia)是一類細(xì)胞內(nèi)專性寄生的單細(xì)胞真核生物，廣泛寄生于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，包括人類：是經(jīng)濟(jì)昆蟲、魚、兔、產(chǎn)毛動(dòng)物、嚙齒類及靈長類的常見病原。自19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲以來，不斷有新的種類被鑒定，目前已發(fā)現(xiàn)有超過150個(gè)屬，1400多個(gè)種。微孢子蟲的孢壁蛋白是微孢子蟲最直接地與宿主接觸的部分，很可能在感染宿主的過程中扮演著重要的角色。本研究在家蠶微孢子蟲孢壁蛋白前期研究的基礎(chǔ)上，建立了

2、一種新的孢壁蛋白的提取方法，分析了不同方法提取蛋白樣品的LC-MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并對三個(gè)孢壁蛋白的表達(dá)譜進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下： 1.純化孢殼后提取孢壁蛋白(GDGC)法的建立 根據(jù)孢子發(fā)芽后彈出原生質(zhì)團(tuán)的特性純化孢殼并結(jié)合沸水浴法建立了GDGC法(Germination & Density Gradient Centrifugation)，即將發(fā)芽后的空孢殼經(jīng)兩次梯度密度離心純化收集，然后用沸水浴法提取孢殼上的

3、孢壁蛋白，SDS＝PAGE結(jié)果顯示此法能提取到主要孢壁蛋白SWP30、SWP32、SWP25，但SWP25和SWP32的蛋白豐度較沸水浴法處理的孢子蛋白樣品中的含量有所降低，將GDG-C法與新鮮和冷凍孢子沸水浴法得到的蛋白樣品、碳酸鉀發(fā)芽新鮮孢子蛋白樣品SDS-PAGE進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)GDGC法的蛋白樣品中兩個(gè)主要孢壁蛋白豐度降低，并能提取到一些新的孢壁蛋白，且蛋白豐度較好。比較得出：此法是一種蛋白來源清楚、較為理想的孢壁蛋白提取方法。

4、 2.不同方法提取孢壁蛋白的比較分析 將沸水浴法、堿溶法分別處理的新鮮和冷凍孢子蛋白樣品、SDS法和Brosson法處理的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE比較分析得出：碳酸鉀發(fā)芽的蛋白樣品中蛋白含量豐富，含有大量孢內(nèi)蛋白，不能用來作為孢壁蛋白的有效提取方法。但冷凍孢子經(jīng)堿液處理時(shí)不再發(fā)芽，經(jīng)觀察孢子形態(tài)完整，此時(shí)提取到的蛋白為堿溶性的孢壁蛋白，但蛋白的種類和豐度不高。SDS法處理的樣品與以前研究一致只能提取到三個(gè)主要孢壁蛋白SW

5、P30、SWP25、SWP32。Brosson法能提取到種類較多的蛋白，但豐度不高，且操作較繁瑣、費(fèi)時(shí)。沸水浴法處理新鮮孢子時(shí)能提取到35～26KD的5個(gè)主孢壁蛋白。(包括SDS法提取到的三個(gè)孢壁蛋白)，冷凍孢子樣品在26KD處的蛋白有缺失，其它與新鮮孢子樣品中的蛋白無異。 3.不同方法抽提孢壁蛋白后的家蠶微孢子蟲的形態(tài)觀察 本研究將不同方法處理后的孢子進(jìn)行吉姆薩染色，鏡檢觀察其形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)新鮮孢子經(jīng)堿溶法處理后均大

6、量發(fā)芽，其中0.1M K2CO3和O.1 M KOH處理的孢子發(fā)芽率均＞85％，0.01 MKOH處理的孢子發(fā)芽率約40％。但孢子經(jīng)冷凍后再用堿液處理時(shí)鏡檢觀察不到發(fā)芽現(xiàn)象，且孢子形態(tài)完整。沸水浴法和SDS法處理后的新鮮和冷凍孢子形態(tài)完整，大小與正常孢子基本保持一致，但處理后的孢子比正常孢子易于著色。 4.家蠶微孢子蟲總蛋白質(zhì)和孢壁蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析 將碳酸鉀發(fā)芽的上清液蛋白質(zhì)樣品，沸水浴法處理的孢子和孢殼的孢壁蛋白樣品分

7、別電泳挖膠進(jìn)行LC-MS/MS分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)允析總共獲得316個(gè)蛋白的信息，按照功能分類主要包括代謝、蛋白靶向、核苷酸合成、蛋白合成、細(xì)胞骨架、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長分化等方面。孢壁蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果顯示找到了12個(gè)假定的孢壁蛋白，其中假定孢壁蛋白NbHSWP1～3分別為已鑒定的孢壁蛋白SWP30、SWP25、SWP32。經(jīng)拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)這12個(gè)假定孢壁蛋白在n.bombycis基因組中7個(gè)呈單拷貝形式，5個(gè)為多拷貝。有3個(gè)假定孢壁蛋白在A

8、.locustae和E.cunivuli基因組數(shù)據(jù)中分別找到了一條相似性序列(相似性在30％～35％之間)，另外在NCBI上進(jìn)行Protein blast比對后，僅有極少的相似性序列并且相似性很低(均低于30％)，這說明孢壁蛋白具有物種特異性。啟動(dòng)子預(yù)測結(jié)果顯示12個(gè)假定孢壁蛋白有三個(gè)預(yù)測有啟動(dòng)子，且都含有TATA-BOX。對三個(gè)孢壁蛋白NbHSWP 1～3的生物信息分析發(fā)現(xiàn)它們均有EST數(shù)據(jù)支持，有磷酸化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)，信號肽長

9、度為17-25個(gè)氨基酸，但均沒有O-糖基化位點(diǎn)。 5.感染不同時(shí)期SWP30、SWP25、SWP32的表達(dá)譜分析 以四齡起蠶添毒，添毒量為每頭蠶106個(gè)孢子，在添毒后12h、24h、36h和2～10d取蠶中腸作為提取RNA的材料，進(jìn)行家蠶微孢子蟲β微管蛋白和三個(gè)孢壁蛋白的RT-PCR檢測。結(jié)果顯示β-tubulin基因的轉(zhuǎn)錄本從12h起到lod的sseDNA中都能檢測到，隨著感染時(shí)間的增長，從添毒第4d起孢子量明顯增多，

10、轉(zhuǎn)錄本的量也相應(yīng)有明顯增多趨勢。孢壁蛋白SWP30和SWP25從家蠶添食孢子36小時(shí)起即孢子進(jìn)入母孢子也即孢子形成期開始檢測到轉(zhuǎn)錄本，隨著感染時(shí)間的增長從3d起轉(zhuǎn)錄本的量明顯增加隨后增長變化不大。SWP32從家蠶添食12小時(shí)即在裂殖體時(shí)期檢測到轉(zhuǎn)錄本，但12～36小時(shí)的轉(zhuǎn)錄本量較微弱，三個(gè)孢壁蛋白均在添食n.bombycis 3d后轉(zhuǎn)錄本的量明顯增加且較β-tubulin增加量明顯，這說明孢壁蛋白在孢子母細(xì)胞增加到最高時(shí)會(huì)有大量的轉(zhuǎn)錄本

11、生成。這可能與孢壁形成有關(guān)。 本研究建立了一種嚴(yán)謹(jǐn)、可靠的提取孢壁蛋白的方法GDGC法，得到了純度幾乎100％的孢殼以提取孢壁蛋白，為孢壁蛋白質(zhì)組的研究打下基礎(chǔ)。獲取了三種不同方法提取的蛋白樣品的LC-MS/MS數(shù)據(jù)，經(jīng)分析找到了12個(gè)假定的孢壁蛋白且其中5個(gè)為多拷貝基因其它7個(gè)為單拷貝，其中3個(gè)預(yù)測有啟動(dòng)子。假定孢壁蛋白NbHSWP1～3分別為孢壁蛋白SWP30、SWP25、SWP32，它們均有EST數(shù)據(jù)支持，信號肽長度為17