家蠶微孢子蟲單克隆抗體G9靶蛋白的鑒定.pdf

1、微孢子蟲(Microsporidia)是一類細胞內(nèi)專性寄生的單細胞真核生物，與其他細胞內(nèi)寄生蟲相似，微孢子蟲具特有的侵染機制。家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis)是Nag(e)li于1857年在病蠶中分離鑒定到的，它能夠感染家蠶，引發(fā)家蠶微粒子病，是蠶業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性病害，因此如何在家蠶感染早期檢測出家蠶微孢子蟲并進行防治，在蠶業(yè)上至關(guān)重要。
　　 1870年，巴斯德創(chuàng)立了母蛾鏡檢法來檢測家蠶微孢子蟲，多年來此方法一直沿

2、用至今，是生產(chǎn)上用于檢測的傳統(tǒng)方法。截止目前，家蠶微孢子蟲的檢測經(jīng)歷了以下階段:顯微鏡檢、分子生物學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測。母蛾鏡檢方法具有簡便、快速、不需要高端儀器的優(yōu)點，但是此方法依賴檢驗人員的判斷，主觀性強?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)利用染色可以提高微孢子蟲的檢出率。透射電子顯微鏡可以觀察到孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)，可以根據(jù)孢子壁厚度、極管圈數(shù)與傾角等基本確定微孢子的種類。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)、LAMP（環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)）被用

3、到微孢子蟲檢測上來。近年來，針對微孢子蟲種間孢壁蛋白抗原性的不同，逐步發(fā)展起了一些免疫學(xué)檢測方法。膠體金免疫層析(GICA)就是利用膠體金本身的顯色特點結(jié)合免疫層析技術(shù)對待檢樣品進行檢測。利用這一原理研制的快速檢測試紙在醫(yī)學(xué)診斷、病原檢測等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大作用。2009年本實驗室利用的家蠶微孢子蟲單克隆抗體G9和孢子發(fā)芽液的兔多抗組裝了試紙條，分別對孢子、感染孢子的母蛾進行了檢測，但還有基礎(chǔ)問題未得到解決，包括試紙條的特異性以及單抗針對的

4、靶蛋白都未確定。
　　 基于以上問題，本文對試紙條進行了特異性、靈敏性的分析，利用免疫沉淀結(jié)合LTQ質(zhì)譜分析的方法找到了單克隆抗體G9的靶蛋白。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶微孢子蟲檢測試紙靈敏性及特異性分析
　　 由于前期實驗室制備的試紙條采用的是將孢子堿處理發(fā)芽后的混合物用點膜的方法檢測的，試紙條檢測的靶標(biāo)存在孢子堿處理后的上清還是沉淀中，尚不清楚，于是我們對孢子堿處理后的組分進行分析，將堿處理的上清和沉

5、淀分開檢測，發(fā)現(xiàn)試紙條檢測靶標(biāo)存在于堿處理后的上清中。對檢測試紙的檢測性能進行分析，開展了特異性性和靈敏性實驗。特異性實驗方面，將柞蠶微孢子蟲(Nosemaantheraeae)、家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclearpolyhydrosisvirus，BmNPV)、家蠶變形微孢子蟲(Vairimorphabombycis)在試紙條上進行檢測，發(fā)現(xiàn)家蠶核型多角體病毒出現(xiàn)非特異性信號。靈敏性實驗中，用0.1mol/L的KO

6、H溶液20μL分別處理約108、107、106、105個孢子，在試紙條上經(jīng)點膜法檢測后發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)孢子數(shù)量為108、107個時才能夠在試紙條上出現(xiàn)檢測信號，重復(fù)實驗兩次，均得出相同結(jié)果。然后用Bradford法測堿處理約108、107個孢子堿處理后上清中蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)兩次測得的平均值分別是1.76μg/μL、0.17μg/L。說明試紙條檢測的最低檢測量為0.17μg/μL。
　　 2.家蠶微孢子蟲堿溶處理條件的優(yōu)化
　　

7、由于試紙條檢測靶標(biāo)存在于堿處理后的上清中，因此本章中對堿處理后的上清（堿溶蛋白）進行研究，同時探索堿溶蛋白的最佳提取條件。首先對堿溶蛋白特異條帶進行LTQ質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示是SWP1。對不同堿性溶液、不同濃度、不同時間、不同溫度、不同pH、不同家蠶發(fā)育階段提取孢子的條件下提取的堿溶蛋白進行了分析。發(fā)現(xiàn)用氫氧化鉀、氫氧化鈉以及碳酸鉀提取的堿溶蛋白均在大小為30kDa處有主帶。不同濃度堿性溶液處理時，30kDa附近主帶首先出現(xiàn)，隨著濃度增大

8、，蛋白條帶變豐富。不同處理時間條件下分析堿溶蛋白，發(fā)現(xiàn)處理5min之后堿溶蛋白就可以在電泳上檢測到條帶，處理90min后蛋白條帶不會增加，且90min以內(nèi)在66kDa附近有蛋白條帶出現(xiàn)，90min以后消失。從溫度對堿溶蛋白的影響實驗中可以看出60℃處理時15kDa附近出現(xiàn)單一的蛋白條帶。在研究pH對堿溶蛋白的影響時，我們用0.1mol/L的KOH溶液提取堿溶蛋白，再將堿溶蛋白的pH用鹽酸中和，分別調(diào)pH到8、9、10，電泳檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH

9、變化時，堿溶蛋白的組分是穩(wěn)定的。堿處理家蠶不同生活史時期提取的孢子時，發(fā)現(xiàn)在家蠶蛹期純化的孢子中提取的堿溶蛋白30kDa附近蛋白量最多。本章節(jié)的研究對堿溶蛋白的組分有了初步了解并且探索到提取堿溶蛋白的最佳條件為:4℃，用0.1mol/LKOH或者NaOH溶液，處理時間不超過90min。
　　 3.家蠶微孢子蟲單克隆抗體G9靶蛋白的鑒定分析
　　 由結(jié)果可知，試紙條能檢測到的靶標(biāo)存在于堿溶蛋白中，堿溶蛋白在試紙條上有檢測信

10、號，并且堿溶蛋白的主要組分是SWP1，而試紙條上使用的金標(biāo)抗體是由單抗G9與膠體金結(jié)合而來，那么單抗G9的靶蛋白必然存在于堿處理后的上清中，因此我們設(shè)計了并開展了免疫沉淀、Westernblotting等實驗。結(jié)果表明，當(dāng)用堿溶蛋白與MAbG9進行免疫沉淀實驗時，單抗G9能從堿溶蛋白中沉淀出一條大小約為30kDa的蛋白，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為SWP1。為進一步驗證質(zhì)譜的結(jié)果，用重組SWP1兔抗與免疫沉淀的結(jié)果進行Westernblotting，

11、結(jié)果顯示SWP1兔抗能識別免疫沉淀中特異的30kDa附近條帶。隨后利用重組SWP1兔抗與堿溶蛋白進行Westernblotting實驗、重組SWP1兔抗和MAbG9分別與堿溶蛋白進行酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗進行驗證，結(jié)果均與免疫沉淀的蛋白免疫印跡實驗結(jié)果一致。綜上，證明單抗G9針對SWP1。確認(rèn)了MAbG9的靶蛋白，就可以純化和富集該蛋白制備該蛋白的高效價多抗，應(yīng)用于試紙條上作為攔截線，改良點膜法，為進一步提高試紙條的靈敏性和特異