蝗蟲微孢子蟲孢壁蛋白的鑒定及功能分析.pdf

1、孢壁蛋白(sporewallprotein)是一類存在于微孢子蟲最外層孢子壁上的蛋白。最近的研究表明這類蛋白在微孢子蟲侵染寄主的過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究提取蝗蟲微孢子蟲的孢壁蛋白，并結合雙向電泳技術對其進行分離，采用質譜技術鑒定出多種可能的孢壁蛋白，通過生物信息學的分析手段，最后對其中的一種孢壁蛋白(A/SWPI)，進行了深入的研究：包括序列分析、基因克隆、原核表達、免疫熒光及免疫電鏡的定位分析，之后又對其表達圖譜進行了研究，并通

2、過GST-pulldown及三維結構模擬初步推測了其潛在功能。主要研究結果如下：
　　 運用SDS-boiling法和Brosson三步法提取了蝗蟲微孢子蟲的總蛋白，并通過雙向電泳技術共分離出了111個蛋白點。絕大部分(70％)蛋白均為堿性蛋白，分子量在30-50kDa，pH值在5-8。將SDS-boiling法提取的蛋白送去做質譜鑒定，共鑒定出了5種蛋白，對這些蛋白進行生物信息學分析后，選定了其中分子量為22.4kDa的假定孢

3、壁蛋白進行深入的研究。
　　 實驗對假定孢壁蛋白經行了基因的克隆，原核表達及免疫印跡的研究。在蝗蟲微孢子蟲體內成功的克隆了此蛋白的編碼基因。之后我們構建原核表達載體pGEX4T-1/ALSWP1，然后在大腸桿菌中誘導表達，并利用GST-Tag進行蛋白的純化。同時，將純化的蛋白免疫兔子，制備抗血清，并進行Westernblotting分析，該結果表明所制備的抗血清可以用于后續(xù)對其進行體內表達定位的研究。
　　 通過間接免疫

4、熒光和免疫電鏡試驗對假定的孢壁蛋白A/SWP1在蝗蟲微孢子蟲生活史不同時期的表達特異性和亞細胞定位特點進行了研究，兩項研究結果均表明該蛋白是一種孢壁蛋白。
　　 對已完成精確定位的A/SWP1在東亞飛蝗中腸組織中的表達譜進行了分析。RT-PCR結果表明：β-tubulin基因的轉錄本在感染后11d才能檢測到其轉錄本，且隨著感染時間的延長擴增的目的條帶亮度也隨著感染時間的增長；在感染后15d才能檢測到ALSWP1目的條帶，且都有較