蝗蟲微孢子蟲孢壁蛋白的鑒定及功能分析.pdf

1、孢壁蛋白(sporewallprotein)是一類存在于微孢子蟲最外層孢子壁上的蛋白。最近的研究表明這類蛋白在微孢子蟲侵染寄主的過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究提取蝗蟲微孢子蟲的孢壁蛋白，并結(jié)合雙向電泳技術(shù)對其進(jìn)行分離，采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出多種可能的孢壁蛋白，通過生物信息學(xué)的分析手段，最后對其中的一種孢壁蛋白(A/SWPI)，進(jìn)行了深入的研究：包括序列分析、基因克隆、原核表達(dá)、免疫熒光及免疫電鏡的定位分析，之后又對其表達(dá)圖譜進(jìn)行了研究，并通

2、過GST-pulldown及三維結(jié)構(gòu)模擬初步推測了其潛在功能。主要研究結(jié)果如下：
　　 運(yùn)用SDS-boiling法和Brosson三步法提取了蝗蟲微孢子蟲的總蛋白，并通過雙向電泳技術(shù)共分離出了111個蛋白點(diǎn)。絕大部分(70％)蛋白均為堿性蛋白，分子量在30-50kDa，pH值在5-8。將SDS-boiling法提取的蛋白送去做質(zhì)譜鑒定，共鑒定出了5種蛋白，對這些蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，選定了其中分子量為22.4kDa的假定孢

3、壁蛋白進(jìn)行深入的研究。
　　 實(shí)驗對假定孢壁蛋白經(jīng)行了基因的克隆，原核表達(dá)及免疫印跡的研究。在蝗蟲微孢子蟲體內(nèi)成功的克隆了此蛋白的編碼基因。之后我們構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX4T-1/ALSWP1，然后在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并利用GST-Tag進(jìn)行蛋白的純化。同時，將純化的蛋白免疫兔子，制備抗血清，并進(jìn)行Westernblotting分析，該結(jié)果表明所制備的抗血清可以用于后續(xù)對其進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)定位的研究。
　　 通過間接免疫

4、熒光和免疫電鏡試驗對假定的孢壁蛋白A/SWP1在蝗蟲微孢子蟲生活史不同時期的表達(dá)特異性和亞細(xì)胞定位特點(diǎn)進(jìn)行了研究，兩項研究結(jié)果均表明該蛋白是一種孢壁蛋白。
　　 對已完成精確定位的A/SWP1在東亞飛蝗中腸組織中的表達(dá)譜進(jìn)行了分析。RT-PCR結(jié)果表明：β-tubulin基因的轉(zhuǎn)錄本在感染后11d才能檢測到其轉(zhuǎn)錄本，且隨著感染時間的延長擴(kuò)增的目的條帶亮度也隨著感染時間的增長；在感染后15d才能檢測到ALSWP1目的條帶，且都有較