25型藍(lán)知病病毒VP7和VP2蛋白的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的，依靠媒介昆蟲（庫蠓、伊蚊等）在反芻動(dòng)物之間傳播的一種烈性非接觸性的傳染病。純種細(xì)毛羊?qū)υ摬∽蠲舾?。BT最早于1876年被發(fā)現(xiàn)，目前在熱帶和溫帶的多個(gè)國家都已分離到BTV，并且該病的分布范圍在不斷的擴(kuò)大，呈現(xiàn)全球性分布的趨勢(shì)。我國于1979年第一次發(fā)現(xiàn)該病的存在，目前在我國29個(gè)省份已檢測(cè)到感染BTV陽性的病畜。迄今為止，全世界范圍內(nèi)共分

2、離到26種不同血清型的BTV，且不同的血清型之間無交叉保護(hù)作用。
　　BTV基因組由10個(gè)雙鏈RNA組成，包括大片段(L1-L3)、中片段（M4-M6）和小片段(S7-S10)。其共編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)。VP7是由S7基因編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由349個(gè)氨基酸組成，位于病毒核衣殼的表面，約占病毒核心蛋白總量36％。VP7是BTV的群特異性抗原，不同血清型之間的

3、VP7蛋白的同源性高達(dá)94％。VP2由L2基因編碼，在不同血清型病毒間保守性最低。VP2蛋白主要參與病毒的吸附和進(jìn)入，與病毒的毒力有關(guān)。VP2可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，是BTV型特異性抗原主要的決定因素。25型BTV是2008年從瑞士山羊血液樣本中分離獲得。25型BTV的VP2與其他血清型病毒VP2的同源性僅為23％-79％。因感染25型BTV的牲畜無典型癥狀，故常被忽略。但是一旦爆發(fā)，發(fā)病率和死亡率較高。因此建立針對(duì)25型BTV的特異性血清

4、學(xué)檢測(cè)方法對(duì)BTV的防控有重要的意義。
　　本研究為制備25型BTV的VP7和VP2蛋白單克隆抗體(Monoclonal antibody，McAb)，利用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a(+)和pGEX-6P-1表達(dá)VP7蛋白，分別命名為VP7a和VP7p。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析大小依次為44 kDa和64 kDa，與預(yù)期蛋白大小一致。采用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a(+)和pMAL-c5X部分重疊表達(dá)三段VP

5、2蛋白，分別命名為VP2-A、VP2-B、VP2-C和VP2-A1、VP2-B1、VP2-C1。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析，大小依次為50kDa、48kDa、48kDa、84 kDa、82 kDa和82 kDa，與預(yù)期蛋白大小一致。分別將重組蛋白VP7a和重組VP2-A、B、C作為免疫抗原，腹腔免疫BALB/c小鼠，采用細(xì)胞融合技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫后小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通過有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆

6、，獲得穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞。分別以VP7p和VP2-A1、B1、C1蛋白作為包被抗原，利用間接ELISA方法進(jìn)行McAb的篩選。共獲得5株穩(wěn)定分泌抗25型BTV VP7的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3H7、5F12、6E10、6G11和1C8;同時(shí)篩選出2株針對(duì)VP2蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2E7和5B3。經(jīng)抗體亞類試劑盒鑒定除1C8為IgM外，其余各株皆為IgG。2E7和5B3經(jīng)抗體亞類試劑盒鑒定分別為IgG1和IgG2b。經(jīng)連

7、續(xù)傳代并凍存復(fù)蘇后，以上7株雜交瘤細(xì)胞皆可穩(wěn)定分泌抗體，具有良好的穩(wěn)定性。間接免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，3H7可與8型BTV發(fā)生特異性結(jié)合，其余各株皆不發(fā)生反應(yīng)，說明該株單抗能夠特異性地識(shí)別8型BTV，且不與赤羽病病毒(AKAV)、茨城病毒(IBAV)、豬輪狀病毒(PRV)發(fā)生交叉反應(yīng)，表明單抗具有良好的特異性。Western blot結(jié)果證明，3H7單抗能識(shí)別重組VP7蛋白;2E7和5B3可特異性識(shí)別重組VP2蛋白。抗原表位疊加試驗(yàn)結(jié)果表