水貂腸炎病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備及膠體金試紙條的研制.pdf

1、水貂病毒性腸炎（Mink viral enteritis）是由水貂腸炎病毒（Mink enteritis virus, MEV）引起的一種急性傳染病。自然條件下主要特性為劇烈腹瀉，幼齡水貂具有較高的發(fā)病率和死亡率。隨著世界毛皮動物飼養(yǎng)業(yè)的快速發(fā)展，水貂病毒性腸炎已經成為危害水貂養(yǎng)殖業(yè)三大疫病之一，給全世界養(yǎng)貂業(yè)帶來巨大的經濟損失。
　　免疫膠體金層析技術（Gold immunochromatography assay, GICA）

2、是免疫層析技術、膠體金標記技術及免疫反應的結合體。膠體金是一種常用的標記技術，以膠體金作為標志物應用抗原、抗體檢測的一種新型的檢測方法，具有簡單快速、結果清晰，可通過肉眼觀察、靈敏度高、無污染和攜帶方便等優(yōu)點。因此該技術得到了迅速發(fā)展，在獸醫(yī)學領域應用也越來越多。
　　本研究采用競爭法建立檢測MEV膠體金試紙條，檸檬酸三鈉還原法制備20 nm的膠體金顆粒與抗MEV單克隆抗體合成金標探針。純化的MEV VP2蛋白包被在NC膜上作為檢

3、測線（T線），羊抗鼠IgG包被在NC膜上作為質控線（C線），組裝成膠體金層析試紙條。
　　根據(jù)水貂腸炎病毒MEVB毒株，設計特異性引物擴增MEV VP2結構蛋白基因獲得1773 bp基因片段；將該基因片段連接到克隆載體上，驗證正確后定向連接到原核表達載體PET-30a，構建MEV VP2基因原核表達重組質粒PET-30a-VP2。將該重組質粒轉化到宿主菌BL21（DE3），重組質粒經酶切和測序鑒定正確后進行誘導表達。IPTG誘導后

4、進行SDS-PAGE和Western blotting分析。結果發(fā)現(xiàn)該蛋白在37?C，誘導劑IPTG終濃度為1.0 mmol/L條件下良好表達，鑒定該重組MEV VP2蛋白以包涵體的形式存在，大小約為70 KD，用鎳柱純化后獲得較純的融合蛋白。
　　采用蔗糖密度梯度超速離心法純化MEVB細胞培養(yǎng)物。經純化的MEVB毒株免疫BALB/c小鼠，制備脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經間接ELISA方法的篩選，獲得6株能穩(wěn)定分泌抗MEV

5、單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為4、6、8、10、13、14。該6株單克隆抗體分別進行了腹水效價測定，結果為單抗4和13抗體效價為1.28×105，單抗6和14抗體效價為2.56×105，單抗8和10抗體效價為5.12×105；特異性試驗鑒定該6株單克隆抗體能與犬細小病毒（CPV）及水貂腸炎病毒（MEV）呈陽性反應，但不與犬瘟熱病毒（CDV）、水貂阿留申病毒（AMDV）及犬腺病毒（CAV）發(fā)生反應；經亞型鑒定，其中單抗4、10為Ig

6、G2b亞型、單抗6為IgG1亞型，單抗8、13、14為IgG2a亞型；間接免疫熒光鑒定該6株單克隆抗體均能使接毒的F81細胞產生綠色熒光；免疫印跡試驗結果顯示該6株單克隆抗體可在約70 KD處出現(xiàn)特異性反應條帶。本試驗為MEV的深入研究、快速診斷方法的建立奠定了基礎。
　　采用檸檬酸三鈉還原法制備出20 nm膠體金顆粒，與抗MEV單克隆抗體10偶聯(lián)形成金標探針。優(yōu)化最佳試紙條各項參數(shù)，將MEV VP2蛋白以0.8 mg/mL的濃度

7、包被于NC膜上作為檢測線（T線），將羊抗鼠IgG以1 mg/mL濃度包被于NC膜上作為質控線（C線）。該膠體金檢測試紙條的敏感性為1:64。該試紙條檢測MEV和CPV樣品為陽性結果，而對CDV、CAV和AMDV等相關病毒樣品檢測均為陰性結果，說明該試紙條特異性良好。與CPV膠體金試紙條方法符合率可達到94.1％。在4?C和25?C條件下可以保存6個月其敏感性和特異性沒有明顯的變化。本研究成功的建立檢測MEV膠體金試紙條，為早期診斷、預防