小鼠合子中DNAL甲基化和H3K9me2修飾的變化及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、表觀遺傳變化是指細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息外的其它可遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，即基因型未發(fā)生改變而表型卻發(fā)生了變化，且這種變化在發(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程中能穩(wěn)定傳遞。表觀遺傳機(jī)制是哺乳動(dòng)物正常發(fā)育和維持組織特異性基因表達(dá)模式所必需的。其中，染色質(zhì)中組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾和DNA自身的甲基化是基因組表觀修飾的兩個(gè)主要機(jī)制，并且這兩種機(jī)制存在相互作用和影響。近年來(lái)深入研究表觀遺傳機(jī)制、不同機(jī)制之間的相互作用和表觀遺傳變化成為熱點(diǎn)。而在小鼠合子發(fā)育階段存在著眾多表觀

2、遺傳修飾的變化，包括雌雄原核DNA甲基化和多種組蛋白修飾的不對(duì)稱現(xiàn)象，因此是一個(gè)很好的研究表觀遺傳機(jī)制的模型。本論文選取了研究比較多、機(jī)制較清楚的DNA甲基化和組蛋白H3K9me2修飾作為研究對(duì)象，對(duì)其在合子發(fā)育期間的變化和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究和探索。
　　 1.小鼠合子期DNA甲基化的變化及其調(diào)控機(jī)制研究
　　 發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化變化的事件已有深入的研究。父源基因組的主動(dòng)去甲基化發(fā)生在受精后的合子早期，接著在分裂期發(fā)

3、生被動(dòng)去甲基化，而在囊胚期發(fā)生重新甲基化。父源基因組在胚胎發(fā)育早期處于低甲基化水平。然而，本文的研究提供了直接和間接的證據(jù)，表明在小鼠胚胎發(fā)育的第一次細(xì)胞周期期間父源基因組發(fā)生了基因組水平的新生DNA甲基化。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)二細(xì)胞初期之前每隔兩小時(shí)的各個(gè)階段DNA甲基化的水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在合子末期的雄原核發(fā)生了低水平的新生DNA甲基化，而在第一次有絲分裂中期父源基因組發(fā)生了全基因組水平的新生DNA甲基化。當(dāng)在培養(yǎng)液中加入Aphidicol

4、in或Cycloheximide時(shí)，體外受精24h后雌雄原核仍不消失，而雄原核的DNA甲基化水平仍然很低。這表明第一次有絲分裂中原核核膜的消失有助于新生DNA甲基化的發(fā)生。
　　 通過(guò)檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt3A和Dnmt3L)的定位，發(fā)現(xiàn)Dnmt3A和Dnmt3L在體外受精14h時(shí)明顯的定位于雄原核內(nèi)。另外，在合子晚期的雄原核異染色質(zhì)區(qū)檢測(cè)到明顯的甲基化信號(hào)。對(duì)比于H4K20三甲基化在雌雄原核上的分布，表明合子中父母源基

5、因組的異染色質(zhì)表觀遺傳修飾標(biāo)記是不同的。
　　 2.小鼠合子期H3K9me2修飾變化及其調(diào)控機(jī)制研究
　　 以前的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠受精卵雌、雄原核組蛋白H3K9甲基化修飾不對(duì)稱，雌原核甲基化，而雄原核檢測(cè)不到組蛋白H3K9甲基化修飾;然而在受精后抑制蛋白質(zhì)合成，在IVF12h的受精卵雄原核中出現(xiàn)明顯的H3K9甲基化修飾。這項(xiàng)研究表明，受精卵雄原核新生組蛋白H3K9甲基化依賴于受精后新生基因組轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。本文對(duì)小鼠

6、合子不同發(fā)育階段H3K9me2修飾進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小鼠合子雄原核在IVF10h及以后檢測(cè)到低水平的H3K9me2修飾。這說(shuō)明在小鼠合子階段存在著兩個(gè)不同的調(diào)控機(jī)制調(diào)控雄原核的H3K9me2修飾。IVF8h之前的階段不依賴于新生蛋白的合成，而是存在某種機(jī)制抑制了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)入雄原核。IVF8h后的階段依賴于新生蛋白的合成。在IVF8-10h期間是這兩種調(diào)控機(jī)制的轉(zhuǎn)換階段，新生蛋白合成需要時(shí)間，不能及時(shí)抑制甲基轉(zhuǎn)移酶活性，因此會(huì)導(dǎo)致低

7、程度H3K9me2的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)使用了對(duì)小鼠合子進(jìn)行處理，然后檢測(cè)小鼠合子雄原核的H3K9me2修飾的變化。結(jié)果說(shuō)明，抑制DNA復(fù)制和抑制細(xì)胞周期蛋白及其依賴性激酶，都不會(huì)改變小鼠合子雄原核的H3K9me2修飾。即DNA復(fù)制過(guò)程和細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程可能都沒(méi)有參與調(diào)控小鼠合子雄原核的H3K9me2修飾。
　　 經(jīng)過(guò)注射G9A抗體和mRNA實(shí)驗(yàn)，去除和過(guò)表達(dá)G9A都對(duì)H3K9me2修飾產(chǎn)生了影響，進(jìn)一步證明了G9A參與調(diào)控了H3K9m

8、e2不對(duì)稱修飾修飾，是Cycloheximide處理后引起小鼠合子階段雄原核H3K9me2的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了GLP的定位情況，同時(shí)進(jìn)行了小鼠合子顯微注射GLP抗體，檢驗(yàn)GLP抗體對(duì)小鼠合子H3K9me2修飾的影響。表明GLP在小鼠合子早期就已進(jìn)入雌雄原核定位，Cycloheximide處理可能增加了GLP的入核，但GLP分布無(wú)雌雄原核不對(duì)稱性，提示GLP可能不參與小鼠合子雄原核H3K9me2修飾的調(diào)控機(jī)制。