NES1基因在胃癌中的表達(dá)及甲基化調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多種基因改變的復(fù)雜過程，包括抑癌基因的表達(dá)缺失及癌基因的激活。正常上皮特異性-1(normalepithelialcell-specific1，NES1)基因，又稱Kallikren10，是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，對腫瘤患者的病情監(jiān)測、估計(jì)預(yù)后、療效評價、檢測疾病復(fù)發(fā)等具有重要作用。NES1在胃癌中的作用尚未完全了解。 目的：研究了NES1基因與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其表達(dá)缺失的

2、相關(guān)機(jī)制，這將有助于我們更深入認(rèn)識胃癌的發(fā)生機(jī)制，并為今后胃癌的早期診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。 方法：1.用Real-timePCR和westernblot分別檢測NES1基因mRNA和蛋白在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)。抽提NES1基因表達(dá)缺失的胃癌細(xì)胞株DNA，用亞硫酸氫鈉(NaHSO4)修飾，采用測序和甲基化特異性PCR(MSP)兩種方法檢測NES1基因在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其與CpG島甲基化的關(guān)系。去甲基化藥物處理NESl基因表達(dá)缺失

3、的胃癌細(xì)胞株，觀察處理前后NES1基因mRNA表達(dá)的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證NES1基因在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)與CpG島甲基化的關(guān)系。2.采用免疫組化和原位雜交的方法分別檢測胃癌活檢標(biāo)本中NES1基因mRNA和蛋白的表達(dá)，探討NES1基因在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床病理聯(lián)系。3.用激光顯微切割的方法分離胃癌組織中的癌細(xì)胞通過Real-timePCR檢測NES1mRNA的表達(dá)。通過甲基化特異性PCR(MSP)及亞硫酸鹽修飾后基因組測序(BSP)兩種方

4、法檢測相應(yīng)癌細(xì)胞中NES1基因的甲基化狀態(tài)，探討NES1基因在胃癌組織中的表達(dá)及與甲基化狀態(tài)的關(guān)系。4.通過基因重組構(gòu)建NES1基因真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株建立穩(wěn)定高表達(dá)NES1基因的胃癌細(xì)胞克??；觀察細(xì)胞增殖情況；應(yīng)用基因腫瘤表達(dá)譜芯片分析轉(zhuǎn)染前后腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的變化，探討NES1基因可能的抑癌機(jī)制，并用Real-timePCR對部分相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：1.NES1基因在5種不同分化類型的人胃癌細(xì)胞株中的表

5、達(dá)明顯低于正常對照組(p＜0.01)。在NES1表達(dá)降低的胃癌細(xì)胞株中其外顯子3CpG島存在部分或完全甲基化。去甲基化藥物可恢復(fù)NES1mRNA在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)缺失并呈一定的濃度依賴性，提示NES1在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)缺失與CpG島異常甲基化有關(guān)。2.NES1蛋自在胃癌活檢組織標(biāo)本中的表達(dá)明顯低于正常組織標(biāo)本，具有顯著性差異(P＜0.05)。其蛋白表達(dá)與年齡、性別、幽門螺桿菌感染、病理分型等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。NES1

6、mRNA在胃癌活檢組織標(biāo)本中表達(dá)的陽性率及強(qiáng)度均顯著低于正常組織標(biāo)本(P＜0.01)，其表達(dá)降低程度與病理分型密切相關(guān)(P＜0.05)，與年齡、性別、幽門螺桿菌感染、病灶的大小、數(shù)目等因素?zé)o關(guān)(p＞0.05)。3.NES1mRNA在顯微切割后胃癌組織細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于周圍正常組織細(xì)胞(P＜0.05)。胃癌組織細(xì)胞中NES1基因外顯子3CpG島具有高比率的異常甲基化現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)了NES1基因甲基化是胃癌發(fā)生的分子病理學(xué)改變。4。穩(wěn)定

7、高表達(dá)NES1基因可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。基因芯片記結(jié)果提示NES1基因轉(zhuǎn)染后引起廣泛的基因變化，這些差異表達(dá)的基因功能涉及多個方面包括信號傳導(dǎo)，細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移等。推測NES1基因的抑癌作用可能是通過參與調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮抑瘤作用的。 結(jié)論：NES1基因外顯子3CpG島異常甲基化是其在胃癌細(xì)胞株和胃癌組織中特異性表達(dá)缺失的機(jī)制之一。NES1mRNA表達(dá)水平與胃癌組織分化程度相關(guān)，提示NES1基因