蝗蟲微孢子蟲侵染宿主的分子機(jī)制.pdf

1、本文探究分析了蝗蟲微孢子蟲的免疫逃避及侵染宿主東亞飛蝗的分子機(jī)制，并以蝗蟲微孢子蟲的胞壁蛋白作為靶標(biāo)初步明確了其侵染宿主之途徑。
　　1.實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用固相雙向電泳(Immobilized pH Gradient two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)和MALDI-TOF-MS等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)分子量為23 kDa蝗蟲微孢子蟲胞壁蛋白，其信號(hào)肽含有19個(gè)氨基酸。將其命名為AlocSWP2，AlocSWP

2、2主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn):含有一個(gè)N糖基化位點(diǎn)、一個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)。
　　2.實(shí)驗(yàn)中將利用成功獲取的目的基因AlocSWP2，進(jìn)行體外原核表達(dá)，成功構(gòu)建原核表達(dá)菌BL21(DE3，pGEX4T-1-AlocSPW2)。超聲破碎BL21(DE3)表達(dá)菌后，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，上清和沉淀中均含有目標(biāo)蛋白，但沉淀中AlocSWP2蛋白含量比上清多，上清中AlocSPW2蛋白含有活性，沉淀中此蛋白形成包涵體。然后將蛋白純化

3、，得到較純的AlocSWP2蛋白。并成功制備多克隆抗血清，利用WesternBlotting法檢測(cè)特異性較好。免疫膠體金實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):AlocSWP2蛋白清楚顯現(xiàn)位于蝗蟲微孢子蟲的孢壁上。
　　3.為探究AlocSWP2蛋白的功能主要進(jìn)行了RNAi干擾、侵染實(shí)驗(yàn)以及GST/His-pull down實(shí)驗(yàn)。RNAi干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:未干擾比干擾的東亞飛蝗AlocSWP2轉(zhuǎn)錄表達(dá)量高約6倍，顯示干擾作用顯著。侵染實(shí)驗(yàn)中，宿主東亞飛蝗出

4、現(xiàn)一些病癥:與健蟲相比較，感染蝗蟲微孢子蟲后的病蟲蛻皮困難，有些病蟲因未能蛻皮導(dǎo)致死亡。行動(dòng)遲緩，體色逐漸變成深褐色，進(jìn)而整個(gè)蟲體發(fā)紅，直至死亡。而在解剖實(shí)驗(yàn)中，觀察到病蟲的中腸出現(xiàn)大面積潰爛，脂肪體消耗殆盡。同時(shí)侵染實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)結(jié)果也印證了存在干擾的可能性，即AlocSWP2在侵染宿主過(guò)程中與免疫相關(guān)，因而RNAi干擾后蝗蟲死亡明顯延遲。
　　4.實(shí)驗(yàn)中利用GST/His-pull down實(shí)驗(yàn)探究東亞飛蝗中腸、脂肪體以及其他組織是