球孢白僵菌超氧化物岐化酶(SODs)的基因克隆、鑒定及功能分析.pdf

1、作為經(jīng)典的絲孢類昆蟲病原真菌，球孢白僵菌因其易于生產(chǎn)和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而在農(nóng)林害蟲防治中廣泛青睞，然而以具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的侵染體為主要活性成分而開發(fā)的生防菌劑，其殺蟲效果往往受到田間各種環(huán)境因素的制約，氧化脅迫就是其所遭遇的重要脅迫因素之一。殺蟲真菌所遭遇的活性氧自由基(ROS)脅迫來自體外和體內(nèi)兩個(gè)方面，一是夏季高溫、陽光中紫外輻射、化學(xué)農(nóng)用等不利環(huán)境因子能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS大量累積；二是作為病原真菌，其在正常條件下侵入宿主體內(nèi)后會(huì)遭遇到

2、宿主昆蟲出于免疫保護(hù)而形成的高ROS細(xì)胞環(huán)境。因此，探索生防真菌對(duì)氧化脅迫的內(nèi)在保護(hù)機(jī)制并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行菌種改良，為提高菌劑抗逆性及毒力提供了新的生物技術(shù)途徑。作為細(xì)胞抗氧化酶系的主要成員，超氧化物歧化酶SOD是細(xì)胞抵抗ROS脅迫的第一道屏障。然而，目前關(guān)于殺蟲真菌SOD基因及其功能的研究報(bào)道幾近空白，十分缺乏有關(guān)這類真菌抗氧化生物學(xué)的科學(xué)認(rèn)識(shí)。為此，本論文試從昆蟲病原真菌抗氧化脅迫的角度出發(fā)，以SOD基因家族為切入點(diǎn)，全面解析球孢白僵

3、菌SOD基因的多樣性及其功能，并嘗試探索用SOD改良菌株毒力及抗逆性的可行性。主要研究內(nèi)容及成果分述如下：
　　 球孢白僵菌Cu/Zn-SOD基因克隆及其免分子伴侶的活性表達(dá)首次從球孢白僵菌Bb2860菌株中克隆到一種新的以Cu/Zn離子為輔基的SOD基因(BbSod1)，并在無SOD特異性分子伴侶CCS的原核表達(dá)體系中通過融合表達(dá)及定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)其高活性表達(dá)。BbSod1編碼區(qū)長465 bp，編碼154個(gè)氨基酸，其編碼的氨基酸序

4、列與已知的57種真菌Cu/Zn-SOD蛋白的同源性為49～96％。BbSod1原態(tài)酶、C端兩個(gè)脯氨酸定點(diǎn)突變(P143S及P145L)酶(BbSod1-Mut)以及融合表達(dá)分子伴侶Lys7的融合酶(BbSod1-Lys7)，均在大腸桿菌中很好地表達(dá)為可溶性重組蛋白。BbSod1-Mut轉(zhuǎn)化株細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的可溶性蛋白粗提液，其SOD活性遠(yuǎn)高于BbSodl-Lys7表達(dá)的同一種酶，而BbSodl原態(tài)酶的表達(dá)則未表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)的活性．工程菌株在37

5、℃培養(yǎng)5h后，添加2.5 mM Cu2+、0.5mMZn2+以及0.5mM IPTG后在20℃下誘導(dǎo)過夜即可獲得最高酶活。這些結(jié)果證明，通過C末端兩個(gè)脯氨酸殘基的定點(diǎn)突變能實(shí)現(xiàn)真菌Cu/Zn-SOD在無分子伴侶的大腸桿菌中高活性表達(dá)，為生產(chǎn)應(yīng)用真菌Cu/Zn-SOD開辟了新的途徑。
　　 球孢白僵菌胞質(zhì)Mn-SOD基因的克隆、鑒定及其對(duì)宿主菌毒力和抗逆性的影響從球孢白僵菌Bb2860菌株中克隆到一種新的Mn-SOD基因(BbSo

6、d2)，編碼209個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與74種已知的真菌Mn-SOD蛋白序列的同源性不超過71％。BbSod2具有Mn-SOD基因家族的所有保守性氨基酸殘基，但其N端缺乏引導(dǎo)成熟蛋白定位于線粒體的前導(dǎo)肽序列。添加Mn2+能顯著提升BbSod2純酶的活性，而Cu2+、Zn2+和Fe3+則對(duì)該酶活性表現(xiàn)抑制作用。在缺乏BbSod2的球孢白僵菌Bb289菌株中超表達(dá)該基因，隨機(jī)挑選的五個(gè)轉(zhuǎn)化子的SOD總活性提高4~10倍。與野生株相比，SO

7、D活性最高(1157.92-74.7 U/mg蛋白)的超表達(dá)轉(zhuǎn)化株的菌落和分生孢子對(duì)氧自由基產(chǎn)生劑甲萘醌的耐受力分別提高93％(EC50:2.41±0.03 vs l.25±0.01 mM)和61％(ECso:0.89±0.06vs0.55±0.07mM)，且其分生孢子對(duì)UV-B輻射的耐受力亦提高23％(LD50:0.49±0.02vs0.39±0.01 J/cm2)。另外，該工程菌株對(duì)斜紋夜蛾一齡幼蟲的毒力增強(qiáng)26％[LT50:4.5

8、(4.2~4.8)vs5.7(5.2-6.4)天]。結(jié)果表明，球孢白僵菌的胞質(zhì)Mn-SOD(BbSod2)能顯著提高該菌的毒力及抗逆性，顯示通過超表達(dá)抗氧化酶有可能改善真菌制劑的田間穩(wěn)定性及毒力．
　　 球孢白僵菌線粒體Mn-SOD基因的克隆及其亞細(xì)胞定位通過序列比對(duì)及簡并引物擴(kuò)增，從球孢白僵菌Bb2860菌株中克隆到一種新的Mn-SOD基因(BbSod3)．該基因全長693 bp，編碼230個(gè)氨基酸，其對(duì)應(yīng)的DNA序列長879

9、 bp，其編碼蛋白的分子量預(yù)測為24.7kDa，等電點(diǎn)約為7.6。BbSod3與已知75種真菌Mn-SOD的同源性為36-93％，擁有Mn-SOD家族的所有保守性氨基酸。在線軟件件MitoProtⅡ預(yù)測分析顯示，該蛋白定位于線粒體的概率達(dá)0.9987，其N端前35個(gè)氨基酸是引導(dǎo)其定位的信號(hào)肽．在此基礎(chǔ)上，通過上述預(yù)測信號(hào)肽序列(Sig)與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的融合表達(dá)(Sig-eGFP)以及線粒體特異性探針MitoTracke

10、r Red的定位標(biāo)記分析，確認(rèn)BbSod3是在其N端的35個(gè)氨基酸殘基的引導(dǎo)下定位于該菌線粒體內(nèi)。
　　 球孢白僵菌胞質(zhì)與線粒體Mn-SOD基因的互作酶型分析及Western雜交證實(shí)球孢白僵菌Bb2860菌株中菌絲體的SOD活性主要來自兩種Mn-SOD，故采用RNA干擾技術(shù)研究BbSod2和BbSod3基因的互作。分別構(gòu)建靶向于BbSod2、BbSod3和同時(shí)靶向二者的表達(dá)發(fā)夾狀RNA干擾結(jié)構(gòu)的干擾載體，轉(zhuǎn)入宿主菌株后，發(fā)現(xiàn)三類

11、干擾載體均能有效下調(diào)各基因轉(zhuǎn)錄量達(dá)70％以上。各干擾反應(yīng)取總SOD活性最低的代表性干擾子C2(針對(duì)BbSod2)、M1(針對(duì)BbSod3)和CM3（針對(duì)二者）與野生株進(jìn)行平行的菌株抗逆性分析。結(jié)果表明，干擾子的菌落(F3,32=3，659，P

12、％．另外，三個(gè)干擾子對(duì)UV-A輻射的敏感性(LD50:15.83±0.66、17.97±0.41、16.96±0.40 J/cm2)亦比野生株(LD50:21.81±0.60 J/cm2)分別提高32％、18％和22％．然而，上述三個(gè)干擾反應(yīng)均不顯著影響菌株對(duì)高溫、高滲透壓和UV-B輻射等脅迫的耐受力。
　　 綜上所述，本研究的成果及創(chuàng)新點(diǎn)主要在于，一是系統(tǒng)研究了了球孢白僵菌中的SOD基因家族，克隆獲得了三種新的SOD基因，為闡

13、釋SOD酶在生防真菌中的功能奠定了基礎(chǔ)。二是通過基因融合及定點(diǎn)突變技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了真菌Cu/Zn-SOD在無專一性分子伴侶CCS的原核表達(dá)系統(tǒng)中的高活性表達(dá)。三是應(yīng)用超表達(dá)和RNA干擾技術(shù)，揭示了胞質(zhì)Mn-SOD在球孢白僵菌抗氧化、耐紫外輻射脅迫及提高菌株毒力方面的重要功能，以及胞質(zhì)與線粒體Mn-SOD的基因互作．這些結(jié)果將有助于推進(jìn)絲孢類殺蟲真菌抗氧化生物學(xué)的研究，展示了從抗氧化保護(hù)酶的新視角改良生防真菌的新思路，并為其它真核Cu/Zn