草莓鑲脈病毒運(yùn)動(dòng)蛋白的鑒定及功能分析.pdf

1、植物病毒編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）在病毒的胞間轉(zhuǎn)移過(guò)程中擔(dān)負(fù)著重要作用。目前，草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）編碼的MP蛋白尚不明確， SVBV侵染寄主植物后，病毒粒子如何實(shí)現(xiàn)胞間轉(zhuǎn)移的機(jī)制也不清楚。因此，本研究利用亞細(xì)胞定位、質(zhì)壁分離、細(xì)胞共定位以及運(yùn)動(dòng)缺陷型病毒載體互補(bǔ)試驗(yàn)等方法，確定了SVBV編碼的P1蛋白是MP蛋白，再利用雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）、酵母雙雜交和凝膠阻滯等試驗(yàn)方法，

2、初步探究了SVBV MP蛋白的胞間運(yùn)動(dòng)模式。另外，本研究制備了SVBV MP蛋白的多抗血清，為更加深入地研究SVBV MP蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　1 SVBV MP蛋白的鑒定
　　克隆SVBV P1基因，插入p1300-YFP，得到重組表達(dá)質(zhì)粒p1300-P1-YFP。插入pBin438，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pBin-P1。
　?。?）P1的亞細(xì)胞定位含p1300-MPTMV-YFP，p1300-P1-YFP和空載體p

3、1300-YFP的農(nóng)桿菌分別浸潤(rùn)本氏煙（Nicotiana benthamiana）葉片，浸潤(rùn)p1300-MPTMV-YFP和p1300-P1-YFP后，熒光在細(xì)胞壁上呈不連續(xù)的點(diǎn)刻狀分布，而浸潤(rùn)空載體p1300-YFP，細(xì)胞壁上沒有出現(xiàn)不連續(xù)的點(diǎn)刻狀熒光。
　?。?）P1與MPTMV的共定位 p1300-P1-YFP與MPTMV-RFP共浸潤(rùn)本氏煙葉片。P1與MPTMV可以在胞間連絲（plasmodesmata, PD）共定位。

4、
　?。?）P1的胞間運(yùn)動(dòng)含p1300-MPTMV-YFP，p1300-P1-YFP和空載體p1300-YFP的農(nóng)桿菌稀釋至OD600=0.001，分別浸潤(rùn)本氏煙葉片，發(fā)現(xiàn)p1300-MPTMV-YFP， p1300-P1-YFP能在本氏煙細(xì)胞間自主運(yùn)動(dòng)并擴(kuò)散到周圍鄰近細(xì)胞，而p1300-YFP僅定位于單個(gè)細(xì)胞，不能向鄰近細(xì)胞擴(kuò)散。
　　（4） P1的運(yùn)動(dòng)回補(bǔ)功能將pBin-P1、pBin-P25及空載體pBin438分別與

5、PVX(△P25)-GFP共浸潤(rùn)本氏煙葉片。結(jié)果表明， pBin-P1與pBin-P25都能夠互補(bǔ)PVX(△P25)-GFP在本氏煙細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)，而空載體 pBin438不能互補(bǔ)PVX(△P25)-GFP在本氏煙細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)。
　　上述研究表明，SVBV編碼的P1蛋白能定位于細(xì)胞外圍，質(zhì)壁分離實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，P1能在細(xì)胞壁上形成不連續(xù)的點(diǎn)刻狀；通過(guò)與MPTMV共定位實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確認(rèn)了P1定位的位置是在PD處；P1不僅具有自主運(yùn)動(dòng)功

6、能，而且能回補(bǔ)運(yùn)動(dòng)缺陷型病毒載體的運(yùn)動(dòng)功能。因此，鑒定SVBV編碼的P1蛋白是MP蛋白。
　　2 SVBV P1蛋白與P4蛋白（CP蛋白）互作的驗(yàn)證
　　克隆SVBV P1和P4基因，分別插入pCV-cYFP和pCV-nYFP構(gòu)建重組表達(dá)載體pCV-P1-cYFP、pCV-P1-nYFP、pCV-P4-cYFP和pCV-P4-nYFP。分別插入pGADT7和pGBKT7構(gòu)建重組表達(dá)載體pGAD-P1、pGBK-P1、pGAD

7、-P4和pGBK-P4。
　?。?）BiFC驗(yàn)證P1與P4的互作將pCV-P1-nYFP與pCV-P4-cYFP及pCV-P1-cYFP與pCV-P4-nYFP分別共浸潤(rùn)本氏煙。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有完整的細(xì)胞出現(xiàn)黃色熒光，確認(rèn)了SVBV編碼的P1蛋白能與P4蛋白互作。
　?。?）酵母雙雜交驗(yàn)證P1與P4的互作將pGAD-P1與pGBK-P4及pGAD-P4與pGBK-P1分別共轉(zhuǎn)化酵母，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅pGAD-P4與pGBK-P1共轉(zhuǎn)

8、化，平板上能夠生長(zhǎng)出白色酵母菌落，說(shuō)明P1能夠與P4互作。
　　3 SVBV P1蛋白與dsDNA結(jié)合能力的驗(yàn)證
　　體外轉(zhuǎn)錄250 bp dsDNA片段，并用[Dig] UTP標(biāo)記，將標(biāo)記后的dsDNA片段和純化的P1蛋白混合孵育，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，顯色后發(fā)現(xiàn)，P1不能阻滯dsDNA的遷移，故P1不具有dsDNA結(jié)合能力。
　　4 SVBV P1蛋白的原核表達(dá)及其多抗血清的制備
　　將P1基因插入原核表達(dá)載