大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及抗逆基因AtNHX5的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、大豆作為世界上重要的糧食和油料作物,其產(chǎn)量和品質(zhì)由于環(huán)境的影響均受到一定制約。在我國土壤鹽堿化是限制大豆產(chǎn)量的重要因素之一,鹽堿化不僅降低耕地的生產(chǎn)力,而且嚴重制約著耕地的可持續(xù)利用,直接影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此,抗鹽新品種的培育成為近些年來研究的熱點和重點。利用農(nóng)桿菌介導法將抗鹽基因轉(zhuǎn)入大豆,綜合運用分子生物學方法與轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗鹽大豆新品種,將為改良鹽堿地提供一條兼有經(jīng)濟、生態(tài)效益的有效途徑。
　　 本研究以河北省推廣大

2、豆品種子葉節(jié)為受體材料,利用農(nóng)桿菌介導法進行遺傳轉(zhuǎn)化條件的摸索,在此基礎上利用優(yōu)化的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系,進行了抗逆基因AtNHX5(CPA1家族的擬南芥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化。獲得主要結(jié)果如下:
　　 1、利用3個河北省推廣的大豆品種進行了農(nóng)桿菌介導的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化條件的摸索,探討了不同萌發(fā)培養(yǎng)基、子葉節(jié)苗齡、外植體預處理溫度、超聲波處理時間及抗氧化劑濃度對農(nóng)桿菌侵染后子葉節(jié)不定芽誘導的影響。結(jié)果表明以萌發(fā)

3、6d、4℃低溫預處理24h的大豆子葉節(jié)為外植體,農(nóng)桿菌侵染后經(jīng)超聲波處理30S、共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加20mg/L抗氧化劑硝酸銀,能明顯提高子葉節(jié)叢生芽誘導率。對五星2號To代進行了報告基因GUS的檢測,獲得PCR驗證陽性植株18株,轉(zhuǎn)化率達0.97％。
　　 2、以優(yōu)化的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系,利用農(nóng)桿菌介導法進行了擬南芥液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因AtNHX5的遺傳轉(zhuǎn)化。T0代經(jīng)PCR檢測,轉(zhuǎn)化率為0.23%,并通過RT-PCR檢

4、測證明目的基因已在轉(zhuǎn)錄水平進行了表達。
　　 3、對PCR檢測為陽性的五星2號T1代幼苗以及對照植株分別滴注100mg/LBasta進行篩選,發(fā)現(xiàn)陽性植株可以將Basta限制在一個較小的范圍內(nèi),褐斑不擴散集中于注射部位,而對照植株葉片大面積褪綠,甚至整片葉枯黃。進一步證明轉(zhuǎn)AtNHX5基因的五星2號轉(zhuǎn)化植株具有一定的除草劑抗性。
　　 4、經(jīng)Basta篩選及PCR檢測均為陽性的五星2號T1代幼苗,經(jīng)200mmol/LNa