溫度變化對(duì)三種硬蜱半胱氨酸蛋白酶活性的影響.pdf

1、硬蜱是一類可寄生于多種溫血?jiǎng)游?包括人)的體外寄生蟲(chóng)。宿主的血液是硬蜱唯一的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。由于硬蜱具有叮咬時(shí)間較長(zhǎng)，吸血量較多以及可多次反復(fù)叮咬等特點(diǎn)，因此被硬蜱叮咬過(guò)的家畜可表現(xiàn)為被毛散落，叮咬處皮膚出現(xiàn)潰、壞死、情緒躁動(dòng)、食欲不振等癥狀；除了以上直接危害之外，硬蜱還可傳播多種病原如細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)、立克次氏體等從而造成人和動(dòng)物患病。
　　 硬蜱生活史較為復(fù)雜，所以國(guó)內(nèi)外學(xué)者多致力于硬蜱生物學(xué)特性的研究。目前全球氣候變暖給硬蜱以及

2、蜱傳病造成了巨大的影響。氣溫升高不僅擴(kuò)大了硬蜱的分布范圍而且促進(jìn)了蜱傳疾病的流行。盡管國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)蜱的分類、生物學(xué)特性等進(jìn)行了大量的研究，但有關(guān)溫度對(duì)硬蜱生物學(xué)特性影響的分子機(jī)制研究很少。半胱氨酸蛋白酶是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的一種新型抗蜱候選分子，同時(shí)也是重要的代謝酶，因此本研究對(duì)三種硬蜱體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶的活性和溫度之間的關(guān)系做了詳細(xì)的探討。
　　 研究首先對(duì)三種硬蜱體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶保守型片段進(jìn)行克隆及同源性分析，之后對(duì)微小扇頭蜱

3、體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行原核表達(dá)并分析其體外活性；在確定了實(shí)驗(yàn)室條件下硬蜱適宜的飼養(yǎng)溫度后，分析溫度變化對(duì)三種硬蜱體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶活性的影響。
　　 1)三種硬蜱半胱氨酸蛋白酶保守序列的獲取
　　 以微小扇頭蜱、亞?wèn)|璃眼蜱、鐮形扇頭蜱cDNA序列為模板，利用半胱氨酸蛋白酶核苷酸序列保守性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆。測(cè)序結(jié)果表明三種硬蜱所得基因片段均含保守區(qū)域并且與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中扇頭蜱屬，革蜱屬的半胱氨酸蛋白酶基因序列的同

4、源性高于80%；與血蜱屬的半胱氨酸蛋白酶基因序列的同源性高于70%。
　　 2)微小扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶全長(zhǎng)序列的克隆、表達(dá)以及活性檢測(cè)
　　 設(shè)計(jì)微小扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶全長(zhǎng)引物，克隆其ORF，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-cys后在大腸桿菌BL21中進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)自我激活后的重組蛋白進(jìn)行活性檢測(cè)。結(jié)果顯示微小扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶基因全長(zhǎng)1041bp，編碼332個(gè)氨基酸，和已報(bào)道的微小扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶基因序列有

5、98%的同源性。只有在酸性條件下自我激活的重組蛋白才可發(fā)揮其水解底物的活性。
　　 3)硬蜱適宜生長(zhǎng)溫度的確定
　　 在實(shí)驗(yàn)室條件下設(shè)定22℃、28℃、37℃三個(gè)溫度級(jí)，分別飼養(yǎng)鐮形扇頭蜱和亞?wèn)|璃眼蜱，觀察不同溫度下各硬蜱各發(fā)育階段的生物學(xué)特性差異。結(jié)果顯示兩種硬蜱幼蜱、若蜱蛻皮率以及卵的孵化率均在28℃時(shí)表現(xiàn)為最佳。
　　 4)溫度差異對(duì)于三種硬蜱半胱氨酸蛋白酶活性的影響
　　 選擇24℃、28℃、32

6、℃三個(gè)溫度級(jí)，分別飼養(yǎng)三種硬蜱，提取三組硬蜱各發(fā)育階段飼養(yǎng)1d、3d、5d的體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶，分別比較各組蛋白酶水解特異性底物的活性。結(jié)果顯示溫度和半胱氨酸蛋白酶活性有關(guān)，在24℃-32℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，同一天內(nèi)幼蜱和若蜱體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶的活性逐漸降低，因此溫度上升提高了其在硬蜱一定發(fā)育階段體內(nèi)的代謝速度，即加速其在硬蜱體內(nèi)的利用。
　　 本研究所獲得的結(jié)果，在全球氣候變暖趨勢(shì)下給蜱以及蜱傳病的防控提供了重要的理論