半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表達(dá)、純化、活性鑒定及應(yīng)用.pdf

1、抗體及相關(guān)的產(chǎn)品的出現(xiàn)標(biāo)志著在制藥領(lǐng)域中一種快速發(fā)展的新興藥物的到來。在癌癥和自身免疫病治療方面,抗體類藥物的重要性日益突出且日漸成為焦點(diǎn)。因此,為了保證藥品質(zhì)量及開發(fā)新藥,對于抗體類大分子的特性及表征分析也顯得格外重要。其中特異性水解大分子抗體對研究抗體的結(jié)構(gòu)及功能有著非常重要的意義。釀膿鏈球菌來源的免疫球蛋白 G降解酶(Immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogen

2、es, IdeS)是一種典型的半胱氨酸水解酶,可以在抗體的鉸鏈區(qū)的特定位點(diǎn)進(jìn)行酶切,使IgG水解為完整的(Fab)2片段和Fc片段,因此可以更直觀、更快捷的提高抗體結(jié)構(gòu)的分辨能力并進(jìn)行更精細(xì)的特征性分析。
　　IdeS獨(dú)特的底物選擇性,使它成為抗體類藥物表征分析的重要工具酶。相關(guān)研究報(bào)道表明,IdeS的酶切特異性要遠(yuǎn)高于其他相關(guān)的蛋白酶,如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、Lys-C等,可以避免酶切后產(chǎn)生非特異性小碎片而導(dǎo)致分析困難。此外,I

3、deS還是一種高性能的蛋白酶,其穩(wěn)定的酶學(xué)活性也擴(kuò)大了它的使用范圍。所以,IdeS是目前為止最適用的抗體類蛋白分析工具酶之一,但是該酶使用量大,目前關(guān)于該酶的提取或制備仍不夠高效,嚴(yán)重限制了該酶的應(yīng)用,新的重組表達(dá)策略成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　然而目前為止,國內(nèi)尚無關(guān)于 IdeS高效制備及特性研究的報(bào)道。因此,為了高效重組表達(dá)IdeS并驗(yàn)證重組IdeS酶的特異性及活性,本論文利用全基因合成方法獲得蛋白酶 IdeS活性區(qū)部分的核苷酸

4、序列并利用 PCR技術(shù)在目的蛋白的羧基端加上His6標(biāo)簽,以利于酶與抗體反應(yīng)結(jié)束后通過純化除去該酶。本文通過融合 GST的方式,使用原核表達(dá)載體pGEX-4T-2可溶性高效表達(dá)出一種全新的重組蛋白酶IdeS,經(jīng)過GST親和層析可以進(jìn)一步高效純化,并在GST融合標(biāo)簽和蛋白酶之間加入腸激酶酶切位點(diǎn),可以方便地進(jìn)行標(biāo)簽的去除。純化出的高純度IdeS酶通過SDS-PAGE、HPLC-SEC和LC-MS進(jìn)行了分析和鑒定,結(jié)果表明:重組蛋白酶Ide

5、S的表達(dá)量高、特異性好、純度高,且在不同緩沖液中均具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,能夠滿足蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析對蛋白酶的高質(zhì)量要求,活性研究表明,IdeS發(fā)揮高活性的PH范圍是5.1~8.0,最適PH是6.6,反應(yīng)溫度在37℃左右。
　　最后,我們通過了一個(gè)特殊的抗體案例,其除了固定的Fc段N-糖基化修飾外,(Fab)2片段上也會有 N-糖修飾或者 O-糖修飾,這可能會在人體引起免疫原性反應(yīng)。而且,糖基化還會影響抗體與初生Fcγ受體(FcγR)的結(jié)合