大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin)的活性、功能及應(yīng)用的研究.pdf

1、半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin是一類專性抑制半胱氨酸類蛋白酶活性的蛋白酶,亦可用于抑制魚糜加工過程中由半胱氨酸類蛋白酶(主要是組織蛋白酶)引起的蛋白降解(又稱凝膠劣化)。
　　基于前期研究結(jié)果,本研究首先以木瓜蛋白酶papain,大黃魚組織蛋白酶LyccathepsinB和L作為目標(biāo)酶檢測(cè)了三種Lyccystatin的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。三種Lyccystatins中,Lyccystatin-1和2的熱穩(wěn)定性總體較差,Ly

2、ccystatin-3的穩(wěn)定性最好,溫度變化時(shí)其抑制活性變化較平和,且對(duì)LyccathepsinB和L的最高抑制活性均出現(xiàn)在40℃左右,與魚糜加工的溫度接近。在不同pH條件下,三種Lyccystatins對(duì)papain的抑制活性都比較穩(wěn)定,Lyccystatin-3對(duì)LyccathepsinB和L及Lyccystatin-2對(duì)LyccathepsinL的抑制活性均在pH7.0時(shí)達(dá)到最大值,Lyccystatin-1對(duì)Lyccatheps

3、inL的抑制活性則在pH9.0時(shí)達(dá)到最大值。
　　隨后我們將三種Lyccystatin用于新鮮大黃魚魚片的處理以及海水雜魚糜、帶魚/鰱魚混合魚糜的加工過程,以衡量Lyccystatin抑制魚片蛋白降解和魚糜凝膠劣化的效果。分別用ddH2O、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TG酶)溶液和Lyccystatin溶液浸泡處理大黃魚魚片后,經(jīng)目測(cè)可觀察到ddH2O處理組魚片出現(xiàn)斷裂、破碎狀態(tài),SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其肌球蛋白降解嚴(yán)重,而TG酶和Lycc

4、ystatin處理組魚片都保存完好,肌球蛋白完整性亦較好;使用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定魚片的剪切力發(fā)現(xiàn):與ddH2O處理組魚片的剪切力相比,Lyccystatin-1、2、3處理組的剪切力分別增加了2倍、3.3倍、3.6倍。P<0.05時(shí)以上各組與ddH2O處理組相比均存在顯著性差異。
　　在魚糜處理實(shí)驗(yàn)中,首先研究了三種Lyccystatin對(duì)海水雜魚糜的凝膠劣化抑制效果。結(jié)果表明,與空白對(duì)照組的凝膠強(qiáng)度相比,Lyccystatin-1、2和

5、3均可明顯抑制魚糜凝膠劣化,凝膠強(qiáng)度分別達(dá)到對(duì)照組的1.4倍,1.3倍和1.6倍。隨后我們研究了Lyccystatin-1和3對(duì)混合魚糜凝膠劣化的抑制效果。通過對(duì)比添加與未添加Lyccystatin的魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度、TPA(硬度,彈性,咀嚼性)、持水性能、白度以及凝膠中肌球蛋白的含量變化,來評(píng)價(jià)Lyccystatin的有效性。結(jié)果顯示:Lyccystatin-3抑制魚糜凝膠劣化的效果明顯優(yōu)于Lyccystatin-1。添加0.25μ

6、g/g的Lyccystatin-3時(shí)魚糜凝膠強(qiáng)度、咀嚼性、硬度、彈性、持水性能和白度分別達(dá)到空白對(duì)照組的2倍,1.4倍,1.2倍,1倍,1.1倍和1.1倍。SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn),肌球蛋白的含量明顯高于對(duì)照組。并且當(dāng)P<0.05,以上指標(biāo)的變化與空白對(duì)照相比均存在顯著性差異。
　　綜上所述,三種Lyccystatin都可有效抑制組織蛋白酶在魚糜加工過程中造成的凝膠劣化現(xiàn)象,其中Lyccystatin-3的抑制效果最好。
　

7、　確定了Lyccystatin-3的應(yīng)用效果之后,采用搖瓶培養(yǎng)優(yōu)化探索了酵母工程菌PichiapastorisSMD1168/Lyccystatin-3的高效表達(dá)條件。發(fā)現(xiàn)使用BMG+復(fù)合維生素+PTM1(富集菌體培養(yǎng)基)/BMM+復(fù)合維生素+PTM1(誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白培養(yǎng)基)配方,流加甘油溶液1d,饑餓培養(yǎng)0.5d,然后流加甲醇溶液誘導(dǎo)表達(dá)5d,Lyccystatin-3表達(dá)量可提高1.7倍,為Lyccystatin-3的進(jìn)一步發(fā)酵罐